This study aimed to standardize a TaqMan Real-Time PCR assay to detect the presence of pathogenic leptospires in urine samples of a dog infected in vitro with standard strains of Leptospira spp. Samples were obtained from a clinically healthy dog, negative to the microagglutination test. Lepto R and Lepto F primers, specific for Leptospira sp and a Lepto TaqMan probe were used, which amplified and hybridized respectively a portion of the rrs gene, differentiating between pathogenic and nonpathogenic species of Leptospira. Thermocycling program was standardized with 35 cycles of 95 °C for 15 s and 60 °C for 1 min with an initial cycle of 95 °C for 5 min. Cycle threshold (Ct) values determined during the standardization of PCR were from 12.53 to 18.21 for the 25 pathogenic strains of Leptospira sp. In contrast, saprophytic Leptospira and other species of bacteria did not produce any specific Ct value. The standard strain was detected up to a dilution of 102 with a Ct value of 29.98 at an efficiency of 1.13 and a correlation coefficient (R2) of 0.993. DNA was detected in infected urine samples from the dilution of 107 leptospires/ml with a Ct value of 17.54 to a minimum dilution of 102 leptospires/ml with a Ct value of 29.87.El presente estudio tuvo como objetivo estandarizar una técnica de PCR en tiempo real con sondas TaqMan para detectar la presencia de leptospiras patógenas en orina de perro infectada in vitro con cepas patrón de Leptospira sp. Las muestras fueron obtenidas de un perro clínicamente sano y negativo a la prueba de microaglutinación. Se utilizaron los cebadores Lepto R y Lepto F, específicos para Leptospira sp y una sonda TaqMan Lepto probe que amplifican e hibridan, respectivamente, una porción del gen rrs, capaces de diferenciar entre especies patógenas y no patógenas de Leptospira. Se estandarizó el protocolo de PCR en 35 ciclos, con un proceso de desnaturalización inicial a 95 °C por 5 min, seguida por una desnaturalización a 95 °C por 15 s y finalmente el alineamiento y extensión en un solo paso a 60 °C por 1 min. Los valores de ciclo umbral (Ct) determinados durante la estandarización de la PCR estuvieron en un rango de 12.53 a 18.21 para las 25 cepas patógenas de Leptospira sp, en tanto que las cepas saprófitas y otros bacterias no dieron productos específicos. El estándar fue detectado hasta una dilución de 102 con un Ct de 29.98 a una eficiencia de 1.13 y con un coeficiente de correlación (R2) de 0.993. Se detectó ADN en las muestras de orina infectada desde la dilución de 107 leptospiras/ml con un valor de Ct de 17.54 hasta una mínima dilución de 102 leptospiras/ml con un valor de Ct de 29.87.