Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas aeruginosa PAO1

Abstract

RESUMEN:La forma característica de la mayoría de las bacterias se atribuye a la peptidoglicana. Este importante constituyente de la pared celular es el responsable de mantener la integridad estructural de la célula soportando la presión interna de turgencia. La biosíntesis de la peptidoglicana es por lo tanto esencial y su papel es único en las bacterias. Como consecuencia, las enzimas involucradas en este proceso complejo constituyen blancos importantes de los antibióticos. Las proteínas que unen penicilina conocidas como PBPs, son esenciales para el crecimiento y la división celular bacteriana, porque catalizan los pasos finales de la síntesis de la peptidoglicana, que se lleva a cabo en el periplasma. Estas PBPs pertenecen a la familia de las acil-serin transfererasas y se han clasificado de acuerdo a su peso molecular en: PBPs de alto peso molecular y PBPs de bajo peso molecular. Todas se encuentran asociadas a la región externa de la membrana citoplásmica y todas poseen un dominio que une a la penicilina. En E. coli se han aislado 13 PBPs, 5 de ellas son de alto peso molecular (1a, 1b, 1c, 2 y 3) y ocho de bajo peso molecular (4, 5, 6, 7, 8, DacD, AmpC y AmpH). Poco se sabe acerca de las PBPs de P. aeruginosa, un patógeno oportunista, que es intrínsecamente resistente a una amplia gama de antibióticos. Las infecciones provocadas por esta bacteria, se tratan a menudo con antibióticos ?-lactámicos y estos antibióticos ejercen sus efectos actuando como sustratos análogos de las PBPs. Se han aislado 8 PBPs de P. aeruginosa, y se ha propuesto que son homólogas a las PBPs de E. coli 1a, 1b, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 basándose en el alineamiento de las secuencias aminoacídicas. Las PBPs de P. aeruginosa 1a y 1b participan en la síntesis general de la PG, la PBP2 en el alargamiento y la conservación de la forma bacilar de la célula y la PBP3, está involucrada aparentemente en la formación del septo de división; las PBPs 4,5 y 7 contribuyen al mantenimiento de la forma; sin embargo, no han sido tan estudiadas como las de E. coli. Para contribuir al entendimiento de la organización, actividad y posible función de una de las PBPs de P.aeruginosa, se realizaron estudios con la PBP3 de este microorganismo. En este trabajo se clonó y se expresó el gen pbp3 y se inmunolocalizó la proteína PBP3 de P.aeruginosa PAO1. Para llevar a cabo lo anterior, se clonó el gen pbp3 de P. aeruginosa en el vector pET30a(+) y se expresó en E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL; la proteína PBP3 expresada se purificó por cromatografía de afinidad con un metal inmovilizado y se determinó por medio de un fraccionamiento celular que esta proteína está asociada a la membrana citoplásmica. Con la PBP3 purificada se obtuvieron anticuerpos específicos que se utilizaron para definir su ubicación que se localizó principalmente en el septo de división celular. Se obtuvo además, una versión truncada de la PBP3, denominada ?PBP3, a la cual se le eliminó su sitio de anclaje en la membrana citoplásmica. En el fraccionamiento celular, esta proteína se localizó preferentemente en el citoplasma, lo que disminuyó notablemente su reclutamiento en el septo de división con la consecuente formación de filamentos largos de células incapaces de dividirse. Con el propósito de determinar la actividad in vivo de las proteínas PBP3 y ?PBP3 se hicieron ensayos turbidimétricos con E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL transformada con las construcciones pbp3-pET30a(+) y ?pbp3-pET30a(+) crecidas en presencia de tres antibióticos ?-lactámicos y se observó que la sobre-expresión de estas proteínas aumentó la resistencia de este microorganismo a Penicilina G, Aztreonam y Cefotaxima. El presente trabajo se realizó con la finalidad de obtener más información sobre la función de la PBP3 en la división celular. La PBP3 es un componente esencial de una red de proteínas cuidadosamente reguladas que participan en la división celular. El estudio de esta importante enzima podría proporcionar datos que ayuden a comprender el grave problema de la resistencia a los antibióticos. Finalmente, los sistemas experimentales usados en este trabajo pueden ayudar a comprender algunas de las características relevantes de la actividad de la PBP3, incluyendo su participación en la formación del septo de división celular.