Phylogenomic study and specific diversity depiction of Frankia genus. Special focus on non-cultivable strains and ecological implications

Abstract

ABSTRACT: The depiction of the phylogenetic structure of the genus Frankia is still troublesome and the evolutionary forces guiding the speciation, dispersion and diversity are not well documented. The current phylogeny has been defined on the basis of the comparative analysis of the 16S rRNA gene sequence while de genomospecies definition is still subjected to DNADNA hybridization trials. Aiming to bring to light the genomic variability of the genus and its translation into the ecological and specific diversity, our studies consisted in, firstly, evaluating the specific diversity within the genus and the ability of the Amplified Fragment Length Polymorphism technique (AFLP) to describe Frankia genomospecies and their phylogenetic liaisons. Moreover this technique was also tested for the study of the non-isolated Frankia directly in the actinorhizal nodules. Secondly, we defined a MLSA (Multilocus Sequence analysis) scheme which allowed us to establish a phylogeny of the genus by using a hundred of strains and for the first time to describe the phylogenetic divergence of a group of non culturable strains exhibiting the particular ability (phenotype) of sporulating in planta (Sp+). The Sp+ strains are distributed into two divergent clades whose structure is highly correlated to the host genotype. The importance of genetic markers having impact over ecology of the strains has been revised. In this regard we have studied the phylogenetic analysis and the occurrence of the genetic components for the siderophore production and of the sodF gene in Frankia.

RESUMEN: La estructura filogenética del genero Frankia aún no es clara, las fuerzas evolutivas que han guiado los procesos de especiación, dispersión y en consecuencia la generación de la diversidad dentro del género no ha podido ser clarificados. La filogenia actual del genero ha sido definida con base en el análisis comparativo de la secuencia del gen 16S rRNA. Por otro lado, la definición de especies genómicas ha sido obstaculizada por las diversas restricciones que impone la técnica de hibridación ADN-ADN. Los trabajos comprendidos en esta tesis doctoral se focalizaron en el estudio de la variabilidad genómica del género y su consecuente traducción en variabilidad específica y ecológica. En primer lugar, evaluamos la diversidad específica del género y la aplicabilidad de la técnica AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) para definir especies genómicas. En seguida, el protocolo establecido fue utilizado para el análisis de cepas no cultivables directamente en nódulos actinorrizicos. Posteriormente, un análisis multilocus, MLSA (Multilocus Sequence Analysis) nos permitió reconstruir la filogenia del género, para tal efecto, una centena de cepas fueron analizadas. Dicho estudio nos permitió por la primera vez describir la divergencia filogenética de un grupo de cepas no cultivables, que presentan como fenotipo característico, la producción de esporangios in planta (llamadas en consecuencia “Sp+”). Las cepas Sp+ aparecen como dos grupos genómicos divergentes entre si y de las cepas Sp-, la estructuración de cada grupo está relacionada al genotipo de la planta hospedero. Finalmente, genes con relevancia ecológica fueron elegidos y empleados como potenciales marcadores filogenéticos de Frankia. Con ese objetivo fijado, estudiamos la presencia y la distribución del gene de la superoxido dismutasa (sodF) asi como los diferentes elementos genéticos implicados en la producción de sideroforos dentro del género.