Obtención de cardiomiocitos a partir de cmmo: evaluación de la diferenciación y funcionalidad para su utilización en cultivos en 3D

Abstract

RESUMEN: La utilización de células madre en la actualidad ha tomado una gran importancia debido a las características que estas células presentan para proliferar y diferenciarse a diversos tipos celulares. Las células madre son células no comprometidas a un linaje celular, que pueden hacer copias exactas de sí misma indefinidamente, ya que tienen capacidad de autorrenovación. OBJETIVOS Obtención y caracterización de cardiomiocitos a partir de células madre mesenquimales derivadas de médula ósea de rata y mediante la diferenciación in vitro. JUSTIFICACION La forma de administración y el número de células a diferenciar no llevan un control y por lo tanto la regeneración del tejido no es óptima. En el presente estudio se pretende diferenciar cardiomiocitos a partir de CMMMO. METODOLOGIA Se obtuvieron muestras de médula ósea de ratas jóvenes de aproximadamente 100 gr de peso, se cultivaron estas células, en medio DMEM suplementado con 10% de SFB y NCS. Estas células fueron monitoreadas con el tiempo, y llevadas a pase III. Se realizo PCR en punto final con marcadores específicos de células mesenquimales SH3, CD70 y como gen endógeno GADPH. Al tiempo que se cultivaron estas células se llevo a cabo otro cultivo con células mas el estimulo de dos diferenciadores de cardiomiocitos como el ácido ascórbico y 5-azacitidina, se realizo una curva dosis-respuesta modificando la molaridad de 5-aza, y se realizó un PCR en punto final con marcadores específicos de cardiomiocitos, troponina cardiaca, cadena pesada de la miosina y NKx2.5. RESULTADOS El PCR de células sin estimulo dio positivo. Se observo que con concentraciones de acido ascórbico + 5-azacitidina a 0.6 y 0.3 M, cambiaba la morfología de las células se probaron los marcadores específicos de mesenquimales, para comprobar si en verdad se está llevando a cabo la diferenciación celular. Lo que se observo fue que el marcador SH3 ya no se expreso en las células diferenciadas, mientras que el marcador CD70 si está presente pero disminuye su expresión a mayor concentración de 5-azacitidina. Esto nos dice que las células están diferenciándose a cardiomiocitos al perder marcadores específicos de mesenquimales y ganando otros.

ABSTRACT: The use of stem cells has now taken a great importance due to the characteristics that these cells have to proliferate and differentiate into various cell types. Stem cells are uncommitted cells to a cell lineage, which can make exact copies of itself indefinitely, as they have self-renewal capacity. AIMS Preparation and characterization of cardiomyocytes from stem cells derived from rat bone marrow and by differentiation in vitro. JUSTIFICATION The method of administration and the number of cells to differentiate are not control and therefore the regeneration of tissue is not optimal. In the present study seeks to differentiate cardiomyocytes from CMMMO. METHODOLOGY samples were obtained from bone marrow of young rats weighing approximately 100 grams, these cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS and NCS. These cells were monitored over time, and brought to pass III. PCR was performed with end-point specific markers of mesenchymal cells SH3, CD70 and as endogenous gene GADPH. While these cells were cultured took out another crop more cell stimulation cardiomyocytes differentiating two of which were ascorbic acid and 5-azacitidine with which we made a dose-response curve by modifying the 5-aza molaridada, make end-point PCR with specific markers of cardiomyocytes, cardiac troponin, myosin heavy chain and Nkx2.5. RESULTS The PCR tested positive cells without stimulus. It was observed that concentrations of ascorbic acid + 5-azacytidine at 0.6 and 0.3 M, changing the morphology of the cells were tested for specific markers of mesenchymal to check if indeed it is conducting cell differentiation. What was observed was that the SH3 marker is no longer expressed in differentiated cells, while the CD70 marker if it is present but its expression decreases at higher concentration of 5-azacitidine. This tells us that the cells are differentiated to cardiomyocyte-specific markers losing and gaining mesenchymal others.