Estudio de la concentración de glutamato extracelular en la región ca3 hipocampal de rata hipotiroidea adulta

Abstract

ABSTRACT: Thyroid hormones exert a crucial role in brain formation, maturation and functionality. The deficiency of thyroid hormones in the adult rat induces hippocampal neuronal damage and also reduces Na+/K+-ATPase activity in that region. It is well known that brain uptake of glutamate and aspartate by excitatory amino acid transporters (EAAT´s) is dependent of Na+/K+-ATPase activity, which maintains Na+ and K+ gradients across cell membranes. Then, it could be possible that impairment of the Na+/K+-ATPase activity in hypothyroid rats produces the rising of extracellular glutamate and aspartate levels which in turn is consequence of an excessive synaptic release and a reduced uptake of these transmitters. The aim of the present study was to investigate the effect of hypothyroidism on extracellular glutamate and aspartate levels, on the vesicular release of excitatory amino acids. Finally, the influence of hypothyroidism on EAAT´s activity in the CA3 hippocampal region was also assessed. Male wistar rats (255-285 g) were randomly separated into three groups: 1) euthyroid or control group drinking tap water; 2) hypothyroid group treated with 60 mg/kg of methimazole in drinking water and 3) replacement group treated with 60 mg/kg of methimazole plus 20 g/kg of thyroxine (SC). After three weeks of treatment, mycrodialysis probes were implanted in the CA3 hippocampal region to collect dialysate samples. Basal glutamate and aspartate levels were measured by HPLC and excitatory neurotransmitters levels were monitored during the perfusion of PDC (Ácido L-transpirrolidina- 2-4-dicarboxilico, 10 mM), a competitive-transportable inhibitor of glutamate transporters, or Ouabain (100 μM), which induces vesicular release of neurotransmitters by inhibition of Na+/K+-ATPase activity. Results show that hypothyroidism decreased extracellular glutamate and aspartate levels. Glutamate levels were restored with thyroxine replacement. The perfusion of PDC increased extracellular excitatory amino acids in all groups tested; the magnitude of the rise was similar in all the experimental groups, thus indicating that hypothyroidism did not modify the activity of the excitatory amino acid transporters. On the other hand, ouabain perfusion increased glutamate levels in euthyroid and replacement groups, but interestingly, it did not have any effect on extracellular glutamate in hypothyroid rats. These results suggest that deficiency of thyroid hormones avoids glutamate synaptic release, probably due a diminished of vesicular glutamate. These results suggest that the extracellular levels of excitatory amino acids, their release and uptake are not involved in neuronal damage induced by hypothyroidism in the CA3 hippocampal region. It is noteworthy; however, that thyroid dysfunction induces changes on other elements of glutamatergic system, particularly glutamate receptors.

RESUMEN: El hipocampo es una región altamente susceptible a la deficiencia de hormonas tiroideas. Durante la etapa adulta de la rata, el hipotiroidismo induce daño neuronal en la región CA3 hipocampal y provoca una menor actividad de la enzima Na+/K+-ATPasa. Dada la importancia de dicha bomba en el mantenimiento de gradientes iónicos y en el adecuado funcionamiento de transportadores de aminoácidos excitadores (EAAT´s) en el cerebro, es probable que la disfunción en la actividad de la bomba Na+/K+-ATPasa en animales hipotiroideos provoque tanto un incremento en la liberación sináptica de glutamato y aspartato, como una deficiencia en la actividad de los transportadores que participan en su recaptura, eventos que conducirían a la acumulación de los aminoácidos excitadores en el espacio extracelular y finalmente a la muerte excitotóxica de las neuronas hipocampicas. Por tal motivo, el objetivo del presente trabajo consistió en evaluar la concentración extracelular de glutamato y aspartato, su liberación por exocitosis y la actividad de los EAAT´s en la región CA3 hipocampal de ratas hipotiroideas. Se emplearon ratas macho de la cepa Wistar (250-285 g), las cuales se dividieron aleatoriamente en tres grupos experimentales, un grupo eutiroideo o control que recibió agua de beber, un segundo grupo al cual se le suministró metimazol (MMI, 60 mg/kg/día, en el agua de beber) para la inducción de hipotiroidismo y un tercer grupo que recibió simultáneamente MMI (60 mg/kg/día, en el agua de beber) y T4 (20 g/kg/día, vía subcutánea). Los tratamientos tuvieron una duración de tres semanas. Al finalizar este periodo, se hizo la implantación de una cánula para microdiálisis en la región CA3 del hipocampo (coordenadas: 4.3 lateral, 4.3 posterior a Bregma y 4.5 mm de profundidad), posteriormente se colectaron muestras de dializados utilizando la técnica de microdiálisis. Se midió la concentración extracelular de glutamato y aspartato, tanto basal como en presencia de PDC (L-trans-pirrolidina-2,4-dicarboxilato, 10 mM), un inhibidor competitivo-transportable de las proteínas que participan en la recaptura de glutamato u ouabaina (100 ?M), compuesto que provoca la liberación sináptica de neurotransmisores debido a la inhibición de la bomba Na+/K+-ATPasa. Los aminoácidos contenidos en los dializados se cuantificaron por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) con detección fluorométrica. Los resultados mostraron que el hipotiroidismo indujo una disminución significativa en la concentración basal de glutamato y aspartato, en tanto que el reemplazo de tiroxina sólo restableció los niveles de glutamato. La administración de PDC aumentó la concentración extracelular de glutamato y aspartato en todos los grupos experimentales. La magnitud del incremento tanto en el grupo hipotiroideo como en el de reemplazo con T4 es semejante a la del grupo control, lo que indica que el hipotiroidismo no modifica la actividad de los transportadores de aminoácidos excitadores. Finalmente, la administración de ouabaina provocó un aumento significativo en la concentración extracelular de glutamato en animales eutiroideos y con reemplazo de T4, sin embargo, dicho efecto no se presentó cuando se perfunde el inhibidor de la bomba Na+/K+-ATPasa en animales tratados con MMI, lo que indica que en las ratas hipotiroideas se encuentra disminuida la liberación sináptica de glutamato, probablemente por una deficiencia del neurotransmisor vesicular. Los resultados sugieren que la concentración extracelular de glutamato y aspartato, la liberación vesicular de los aminoácidos excitadores y sus mecanismos de transporte no están asociados al daño neuronal hipocampal inducido por hipotiroidismo, sin embargo, no descartamos la posibilidad de que la deficiencia tiroidea induzca cambios sobre otros componentes del sistema glutamatérgico capaces de desencadenar la muerte excitotóxica de las neuronas piramidales del hipocampo.