Estudio de las interacciones de la dineína con la región citoplásmica de CD155 y con el virión de poliovirus

Abstract

RESUMEN: Aunque el mecanismo exacto aún es desconocido, se ha propuesto que uno de los medios por medio del cual poliovirus se disemina al el Sistema Nervioso Central (SNC) es través de los nervios periféricos mediante proteínas motoras involucradas en el transporte axonal retrógrado. Se ha propuesto que poliovirus ingresa a las neuronas desde la sinápsis mediante una endocitosis mediada por el receptor humano de poliovirus (CD155). Una vez que el virus, unido a su receptor, ha sido introducido en el endosoma, es posible que la porción citoplásmica de CD155, localizada en la superficie de la vesícula, interaccione con la dineína citoplásmica, la cual, a su vez, realice el desplazamiento del endosoma, junto con su contenido a lo largo de los microtúbulos, para transportar al virus desde la terminal sináptica hasta el soma neuronal. La finalidad de este trabajo fue determinar si proteínas motoras, como la dineína, interactúan con la región citoplásmica del receptor de poliovirus humano (CD 155) abriendo la posibilidad de que ésta última molécula actuara como intermediario entre el virus y la proteína motora para la diseminación hacia el SNC. Por otro lado, se analizó la posible interacción de la dineína con la cápside de poliovirus con el fin de comprender si el virus es capaz de interactuar directamente con las proteínas motoras para su transporte hacia el cuerpo neuronal. Para confirmar si la región citoplásmica de CD155 interactúa con la dineína citoplasmática, se trabajó con proteínas de fusión GST, de las cuales, una de ellas expresa la región citoplasmática de CD155α. Estás proteínas se hicieron interactuar con el extracto S10 de la línea celular SH-SY5Y de neuroblastoma humano como fuente de dineína. Las interacciones resultantes se recuperaron por cromatografía de afinidad GST-glutatión y se identificaron con anticuerpos monoclonales contra proteínas motoras. Por otra parte, para determinar si poliovirus tiene la capacidad de unirse directamente con la dineína citoplásmica, se realizó una cromatografía de afinidad, donde se realizaron interacciones de proteínas provenientes de la línea celular de neuroblastoma con poliovirus purificado y acoplado a resina de sefarosa 4B activada con bromuro de cianógeno. Nuestros resultados mostraron que el receptor de poliovirus humano CD 155 no se une a la dineína bajo las condiciones experimentales realizadas, por lo que no podemos aseverar que CD155 actúe como intermediario entre poliovirus y las proteínas motoras en la diseminación del virus hacia el SNC. Sin embargo, la interacción entre poliovirus y la dineína mostró que esta proteína motora puede unirse directamente al virus sin necesidad de emplear su receptor CD155 como intermediario. Estos hallazgos nos sugieren que poliovirus, al igual que otros virus que afectan al SNC, pudiera diseminarse hacia las astas anteriores de la médula espinal sin que se requiera la presencia de su receptor específico.

ABSTRACT: Even the exact mechanism is unknown, it has been proposed that poliovirus can spreads to central nervous system mainly through the neural pathway by means of motor proteins implicated in the retrograde axonal transport. It has been proposed that the human poliovirus receptor (hPVR) CD155 plays an important role in the neurovirulence of poliovirus inoculated by neuro-muscular injury. If a role of hPVR in the spread of the virus is considered, it is possible that, in the nervous, poliovirus is enclosed by endosomes as a result of hPVR-mediated endocytosis. One possibility, is that while the virus remains attached to the receptor, the cytoplasmic domain of the poliovirus receptor CD155 localizes to the external endosome surface, could interact with the cytoplasmic dynein and then, the endosome complex moves from the synapses to the neural cell body, where uncoating and replication of poliovirus occur. In this work, the objective was determine if motors proteins, like cytoplasmic dynein, could interact with the cytoplasmic domain of the poliovirus receptor CD155, and this event could mediate retrograde transport of poliovirus through the dynein endosome complex to neuron cell. On the other hand, we analyzed the possibility that the capsid of poliovirus could interact directly with the cytoplasmic dynein and then, the cytoplasmic dynein-poliovius complex was taken up at the neural cell body, without of CD155 participation. To confirm the interaction of CD155 with the cytoplasmic dynein, we using GST fusion proteins. One fusion protein expressed the C-terminal peptide of CD155α (the cytoplasmic domain of the poliovirus receptor CD155α ). These proteins was incubated with a cytoplasmic cell lysate of the human neuroblastoma cell line SHSY5Y. The GST fusion proteins, bound to glutathione-agarose beads, were used in a GST-pull down assay to determine affinities to cytoplasmic dynein. The material bound to the glutathione-beads was analyzed by immunoblotting with goat monoclonal anti-dynein antibody. To prove if poliovirus could bind to cytoplasmic dynein, poliovirus was bound to sepharose-beads 4B activated with cyanogen bromide, and interacted with a cytoplasmic cell lysate of human neuroblastoma. The eluides were analyzed by immunoblotting. Our data indicated that the cytoplasmic domain of poliovirus receptor CD155 did not associate with the dynein under the conditions used in our laboratory. However, we cannot in affirm that CD155 could be a bridge between poliovirus and motor protein and then, spreads toward to central nervous system. We evidenced the poliovirus and cytoplasmic dynein interaction without intermediates, like CD155. Our data suggest that poliovirus could spread to CNS without the participation of its cellular receptor CD155.