http://purl.org/coar/resource_type/c_db06
Bioprocess Development of an Extremophilic Methanotroph and Microalgae Coculture for the Production of a Novel Proteinaceous Biofeed
Fecha
2022Autor
Cartín Caballero, Carlos Manuel
Institución
Resumen
Industrial methane (CH4) and carbon dioxide (CO2) emissions are potent greenhouse gases, and their
abatement has become the focus of global warming control strategies. Aerobic methane oxidizing
bacteria (methanotrophs), offer the potential to biologically convert CH4 emissions into single cell protein
(SCP) feed for cattle, fish, or poultry. The oxygen requirement for methanotroph activity, however,
presents a safety challenge, as methane-oxygen mixtures become explosive between 5% and 15%
CH4 by volume in air. A potential solution to this problem could be to coculture methanotrophs with
oxygenic photoautotrophic microalgae in a dilute O2 environment. The objective of this thesis was to
demonstrate proof-of-concept for a novel biotechnological platform with the capability to convert low
value CH4/CO2 gas waste streams into supplementary biofeedstocks by using a coculture of
thermoacidophilic methanotrophic bacteria and photoautotrophic microalgae. Cocultures of the methanotroph, Methylacidiphilum sp. RTK17.1, and the microalga, Galdieria sp. RTK37.1, were conducted in batch and continuous systems to determine their performance and stability. Coculture performance was compared to corresponding axenic cultures, and the nutritional suitability of resultant biomass as single cell protein feedstock was assessed. Stable coculture was achieved in both batch and chemostat configurations. In batch, presence of Galdieria sp. RTK37.1 significantly enhanced growth (29 %) and methane oxidation (300 %) rates of Methylacidiphilum sp. RTK17.1 (p-values < 0.05 and < 0.001 respectively), and complete methane removal was achieved without O2 or air supplementation. In chemostat experiments, Galdieria decreased net volumetric O2 consumption by 46% in coculture, but its oxygenic activity was unable to supply Methylacidiphilum with the O2 required for complete CH4 removal. Methylacidiphilum sp. RTK17.1, Galdieria sp. RTK37.1, and their coculture each displayed similar nutritional profiles, with protein quality comparing favourably to soybean meal and fishmeal feeds used for animals. It was concluded that Methylacidiphilum benefited from the presence of Galdieria in microaerobic environments; with interspecies O2 cross-feeding deemed to play a fundamental role in their interactions.
Existing photoautotroph-methanotroph coculture studies have suffered from a lack of rapid methods to
quantitatively evaluate coculture dynamics. Therefore, I developed a technique for measuring the
relative abundance of Methylacidiphilum sp. RTK17.1 and Galdieria sp. RTK37.1 in cocultures using a
combination of differential sedimentation, optical density, and fluorescence methodologies (DSOF
Method). The validity of the DSOF method was tested using artificial non-growing ethylacidiphilum Galdieria mixtures across a wide range of defined biomass concentrations (OD600). The validation showed the absolute error of the derived biomass concentration values was negligible (≤ ± 0.1 A.U.) when [Galdieria] ≤ 2.0 A.U. and [Methylacidiphilum] ≤ 1.5 A.U. These errors increased to ± 0.2 A.U, for 2.0 A.U. < [Galdieria]K ≤ 3.23 A.U. DSOF method validation in actively growing cocultures showed that
the derived Methylacidiphilum-Galdieria concentrations were consistent with their expected growth
behaviour and prior observations. In conclusion, the DSOF method was determined to be an easy and
accurate method to rapidly quantify the relative concentration of Methylacidiphilum sp. RTK17.1 and
Galdieria sp. RTK37.1 in coculture. In order to evaluate the influence of proportional abundance on coculture performance, several batch cocultures with variable initial Methylacidiphilum:Galdieria mass ratios (with and without CH4) were performed. For cocultures with dilute initial mass ratio (< 0.18 gDW L
-1: gDW L-1) CH4-containing cocultures fixed more net carbon compared to non CH4-containing cocultures (17 – 28 % increase, p-value < 0.05); as the microalgae supplied the O2 required for methane oxidation. However, for CH4-containing cocultures with initial Methylacidphilum:Galdieria mass ratios ≥ 0.23 there was a significant reduction of growth rates (66 –100 %, p-value <0.001) and net carbon fixation (44 – 62 %, p-value < 0.001). Under these conditions, the photo pigment intermediate coproporphyrin, was excreted, and Galdieria sp. RTK37.1 exhibited dramatic chlorosis. Coproporphyrin excretion and subsequent chlorosis was triggered by O2 limitation, as neither were observed if O2 and CH4 were regularly replenished in coculture. It was concluded that photoautotrophically grown Galdieria sp. RTK37.1 requires a minimum concentration of O2 to enable adequate pigment production, and that Methylacidiphilum’s high affinity for O2 can induce chlorosis in the microalgae. Batch coculturing complicates the analysis of potential interspecies interactions as conditions change continuously with time. Furthermore, steady state coculturing helps understand interspecies interactions under defined stable environmental conditions. Therefore, interactions between Methylacidiphilum sp. RTK17.1 and Galdieria sp. RTK37.1 in low O2 environments, during steady state continuous coculture were investigated. By changing the O2 inlet concentration of steady state continuous axenic cultures and cocultures, it was established that O2 concentration and net uptake/production rates determined the nature of Methylacidiphilum-Galdieria interaction in cocultures. In chemostat coculture at inlet O2 < 2.1% (D.O ≤ 0.198 ± 0.003 mgO2 L -1 ) the interaction was inhibitory for Galdieria: Methylacidiphilum sp. RTK17.1 benefited from Galdieria sp. RTK.37.1, while at the same time harming the microalga by inducing O2-limitation related chlorosis. At inlet O2 between 2.1-3.0 % (v/v) the relationship became neutral for Galdieria: Methylacidiphilum exhibited faster growth, presumably due to greater O2 availability, allowing CH4 to be oxidized further, without seemingly affecting Galdieria. It was concluded that the nature of the interaction between Methylacidiphilum sp. RTK17.1 and Galdieria sp. RTK37.1 is dependent on the dissolved O2 concentration, and thus, its monitoring and control is of vital importance for successful cocultures. Collectively, the obtained results indicate that O2 plays a fundamental role in Methylacidiphilum Galdieria interactions. In general, if O2 is limiting, Methylacidiphilum RTK 17.1 benefits from Galdieria photosynthetic activity. However, if Methylacidiphilum related O2 consumption exceeds Galdieria photosynthetic O2 production, the methanotroph can harm the microalgae. This O2 limitation in Galdieria causes the chlorophyll and phycocyanin intermediate, coproporphyrinogen III, to be excreted into the media where it is oxidized into coproporphyrin III. This stops pigment synthesis, which eventually results in pigment degradation (chlorosis). This chlorosis was reversible, however, as pigment synthesis eventually resumed if headspaces were allowed to accumulate O2. In conclusion, balancing O2
production/consumption is vital in Methylacidiphilum sp. RTK17.1 and Galdieria sp. RTK37.1 cocultures.
This research has made significant contributions to the understanding of Galdieria spp., photoautotroph-methanotroph cocultures in general, and more specifically to thermoacidophilic cocultures. It provides vital insight into how O2 concentrations affect Methylacidiphilum-Galdieria cocultures. This interspecies dynamic will serve as the foundation for the conceptualization and design of systems to improve coculture performance. Additionally, the DSOF method enables a simple method to rapidly quantify the relative concentration of microalgae and methanotrophs in coculture. This research expands understanding of photoautotroph-methanotroph cocultures and provides a proof-of principle for thermoacidophilic SCP bioprocesses. These thermoacidophilic cocultures, which were not previously investigated, offer great potential to convert low (or negative) value industrial gas streams into valuable products (e.g. supplementary biofeedstocks). Las emisiones industriales de metano (CH4) y dióxido de carbono (CO2) son potentes gases de efecto invernadero y su reducción se ha convertido en el centro de las estrategias de control del calentamiento global. Las bacterias aeróbicas oxidantes de metano (metanótrofas) ofrecen el potencial de convertir biológicamente las emisiones de CH4 en alimento de proteína unicelular (SCP) para ganado, peces o aves de corral. Sin embargo, el requerimiento de oxígeno para la actividad metanótrofa presenta un desafío de seguridad, ya que las mezclas de metano y oxígeno se vuelven explosivas entre el 5 % y el 15 % de CH4 por volumen en el aire. Una posible solución a este problema podría ser cocultivar metanótrofos con microalgas fotoautótrofas oxigénicas en un entorno de O2 diluido. El objetivo de esta tesis fue demostrar la prueba de concepto de una nueva plataforma biotecnológica con la capacidad de convertir flujos de residuos de gas CH4/CO2 de bajo valor en bioalimentos suplementarios mediante el uso de un cocultivo de bacterias metanotróficas termoacidofílicas y microalgas fotoautótrofas. Cocultivos del metanótrofo, Methylacidiphilum sp. RTK17.1, y la microalga Galdieria sp. RTK37.1, se realizaron en sistemas discontinuos y continuos para determinar su rendimiento y estabilidad. El rendimiento del cocultivo se comparó con los cultivos axénicos correspondientes y se evaluó la idoneidad nutricional de la biomasa resultante como materia prima de proteína unicelular. Se logró un cocultivo estable tanto en configuraciones por lotes como en quimiostatos. En lote, presencia de Galdieria sp. RTK37.1 mejoró significativamente las tasas de crecimiento (29 %) y oxidación de metano (300 %) de Methylacidiphilum sp. RTK17.1 (valores de p < 0,05 y < 0,001 respectivamente), y se logró la eliminación completa de metano sin suplementos de O2 o aire. En experimentos con quimiostatos, Galdieria redujo el consumo volumétrico neto de O2 en un 46 % en el cocultivo, pero su actividad oxigenada no pudo suministrar a Methylacidiphilum el O2 necesario para la eliminación completa del CH4. Methylacidiphilum sp. RTK17.1, Galdieria sp. RTK37.1 y su cocultivo mostraron perfiles nutricionales similares, con una calidad de proteína que se compara favorablemente con la harina de soya y los alimentos de harina de pescado utilizados para animales. Se concluyó que Methylacidiphilum se benefició de la presencia de Galdieria en ambientes microaeróbicos; y se considera que la alimentación cruzada de O2 entre especies juega un papel fundamental en sus interacciones. Los estudios de cocultivo fotoautótrofos-metanótrofos existentes han sufrido la falta de métodos rápidos para evaluar cuantitativamente la dinámica del cocultivo. Por lo tanto, desarrollé una técnica para medir la abundancia relativa de Methylacidiphilum sp. RTK17.1 y Galdieria sp. RTK37.1 en cocultivos utilizando una combinación de metodologías de sedimentación diferencial, densidad óptica y fluorescencia (método DSOF). La validez del método DSOF se probó utilizando mezclas artificiales de etilacidiphilum Galdieria sin crecimiento en una amplia gama de concentraciones de biomasa definidas (OD600). La validación mostró que el error absoluto de los valores de concentración de biomasa derivados era insignificante (≤ ± 0,1 A.U.) cuando [Galderia] ≤ 2,0 A.U. y [Methylacidiphilum] ≤ 1,5 A.U. Estos errores aumentaron a ± 0,2 A.U, para 2,0 A.U. < [Galderia]K ≤ 3.23 A.U. La validación del método DSOF en cocultivos en crecimiento activo mostró que las concentraciones derivadas de Methylacidiphilum-Galdieria eran consistentes con su comportamiento de crecimiento esperado y observaciones previas. En conclusión, se determinó que el método DSOF es un método fácil y preciso para cuantificar rápidamente la concentración relativa de Methylacidiphilum sp. RTK17.1 y Galdieria sp. RTK37.1 en cocultivo. Con el fin de evaluar la influencia de la abundancia proporcional en el rendimiento del cocultivo, se realizaron varios cocultivos por lotes con relaciones de masa de Methylacidiphilum:Galdieria iniciales variables (con y sin CH4). Para los cocultivos con una relación de masa inicial diluida (< 0,18 gDW L-1: gDW L-1), los cocultivos que contenían CH4 fijaron más carbono neto en comparación con los cocultivos que no contenían CH4 (aumento de 17 a 28 %, valor p < 0,05); ya que las microalgas aportaron el O2 necesario para la oxidación del metano. Sin embargo, para los cocultivos que contenían CH4 con proporciones de masa iniciales de Methylacidphilum:Galdieria ≥ 0,23, hubo una reducción significativa de las tasas de crecimiento (66 – 100 %, valor de p < 0,001) y la fijación neta de carbono (44 – 62 %, valor de p < 0,001). En estas condiciones, el fotopigmento intermedio coproporfirina se excretó y Galdieria sp. RTK37.1 exhibió una clorosis dramática. La excreción de coproporfirina y la subsiguiente clorosis fueron provocadas por la limitación de O2, ya que tampoco se observaron si O2 y CH4 se reponían regularmente en el cocultivo. Se concluyó que Galdieria sp. RTK37.1 requiere una concentración mínima de O2 para permitir la producción adecuada de pigmentos, y que la alta afinidad de Methylacidiphilum por el O2 puede inducir clorosis en las microalgas. El cocultivo por lotes complica el análisis de posibles interacciones entre especies ya que las condiciones cambian continuamente con el tiempo. Además, el cocultivo en estado estacionario ayuda a comprender las interacciones entre especies en condiciones ambientales estables definidas. Por lo tanto, las interacciones entre Methylacidiphilum sp. RTK17.1 y Galdieria sp. Se investigó RTK37.1 en entornos bajos en O2, durante el cocultivo continuo en estado estacionario. Al cambiar la concentración de entrada de O2 de los cocultivos y cultivos axénicos continuos en estado estacionario, se estableció que la concentración de O2 y las tasas netas de absorción/producción determinaban la naturaleza de la interacción Methylacidiphilum-Galdieria en los cocultivos. En el cocultivo de quimiostatos a la entrada de O2 < 2,1% (D.O ≤ 0,198 ± 0,003 mgO2 L -1 ) la interacción fue inhibitoria para Galdieria: Methylacidiphilum sp. RTK17.1 se benefició de Galdieria sp. RTK.37.1, mientras que al mismo tiempo daña la microalga al inducir clorosis relacionada con la limitación de O2. En la entrada de O2 entre 2,1-3,0 % (v/v), la relación se volvió neutral para Galdieria: Methylacidiphilum exhibió un crecimiento más rápido, presumiblemente debido a una mayor disponibilidad de O2, lo que permitió que el CH4 se oxidara aún más, aparentemente sin afectar a Galdieria. Se concluyó que la naturaleza de la interacción entre Methylacidiphilum sp. RTK17.1 y Galdieria sp. RTK37.1 depende de la concentración de O2 disuelto y, por lo tanto, su seguimiento y control es de vital importancia para el éxito de los cocultivos. En conjunto, los resultados obtenidos indican que el O2 juega un papel fundamental en las interacciones de Methylacidiphilum Galdieria. En general, si el O2 es limitante, Methylacidiphilum RTK 17.1 se beneficia de la actividad fotosintética de Galdieria. Sin embargo, si el consumo de O2 relacionado con Methylacidiphilum excede la producción fotosintética de O2 de Galdieria, el metanótrofo puede dañar las microalgas. Esta limitación de O2 en Galdieria hace que el intermedio de clorofila y ficocianina, coproporfirinógeno III, se excrete en los medios donde se oxida a coproporfirina III. Esto detiene la síntesis de pigmentos, lo que eventualmente resulta en la degradación del pigmento (clorosis). Sin embargo, esta clorosis era reversible, ya que la síntesis de pigmentos finalmente se reanudaba si se permitía que los espacios de cabeza acumularan O2. En conclusión, equilibrar la producción/consumo de O2 es vital en Methylacidiphilum sp. RTK17.1 y Galdieria sp. Cocultivos RTK37.1. Esta investigación ha hecho contribuciones significativas a la comprensión de Galdieria spp., cocultivos fotoautótrofos-metanótrofos en general, y más específicamente a los cocultivos termoacidofílicos. Proporciona información vital sobre cómo las concentraciones de O2 afectan los cocultivos de Methylacidiphilum-Galdieria. Esta dinámica entre especies servirá como base para la conceptualización y el diseño de sistemas para mejorar el desempeño del cocultivo. Además, el método DSOF permite un método simple para cuantificar rápidamente la concentración relativa de microalgas y metanótrofos en el cocultivo. Esta investigación amplía la comprensión de los cocultivos fotoautótrofos-metanótrofos y proporciona un principio de prueba para los bioprocesos SCP termoacidofílicos. Estos cocultivos termoacidofílicos, que no se investigaron previamente, ofrecen un gran potencial para convertir flujos de gases industriales de valor bajo (o negativo) en productos valiosos (p. ej., materias primas biológicas suplementarias).