Implementación del ensayo de 2′,7′-Diclorodihidrofluoresceina diacetato (DCFH-DA) para la evaluación de estrés oxidativo intracelular en modelos in vitro de cáncer colorrectal y seno

Abstract

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son subproductos naturales del metabolismo oxidativo, y juegan un papel importante a nivel celular en la modulación de la homeostasis redox. El ensayo de 2'-7'-Diclorofluoresceina diacetato (DCFH-DA) es empleado con frecuencia para cuantificar la producción de ROS intracelular, por ser económico, sencillo y reproducible. El reactivo se encuentra en forma de éster, un compuesto relativamente polar y permeable a la membrana, que se hidroliza por las esterasas celulares para ser convertido en diclorodihidrofluoresceina (DCFH), un compuesto no fluorescente y polar, que será oxidado en presencia de las ROS, convirtiéndose a 2',7'-diclorofluoresceína (DCF), un producto altamente fluorescente que se acumula en la célula. Pese al amplio uso de este ensayo para determinar estrés oxidativo, se han reportado diferentes condiciones experimentales que condicionan una correcta cuantificación de ROS intracelular. Teniendo en cuenta esto, en este trabajo se establecieron las condiciones óptimas para inducir y cuantificar estrés oxidativo empleando el ensayo DCFH-DA. Como modelo de estudio se emplearon las líneas celulares MCF-7 y HT-29, evaluando el efecto de dos inductores de ROS (H2O2 y doxorrubicina). Por medio de fluorometría se evaluó el efecto de la concentración del inductor, el tiempo de reacción y el medio de disolución del ensayo. Los resultados obtenidos sugieren que el H2O2 es un mayor inductor de ROS en MCF-7, aumentando la producción de ROS 1,96 veces respecto al control después de 24 horas a 0,04 %v/v. Este mismo incremento se observó en HT-29 pero usando H2O2 a 0,16 %v/v, mostrando diferencias estadísticamente significativas respecto al control (Kruskal-Wallis post-hoc mann Whitney con un P< 0,05). Adicionalmente, se demostró que la cuantificación de ROS se ve afectada por la exposición a la luz, se debe usar PBS como medio de disolución y tiempos de reacción no mayores a 30 minutos. El ensayo se estandarizó para medir estrés oxidativo intracelular en ambas líneas celulares, obteniendo resultados reproducibles basados en la normalización por concentración de proteína. Finalmente, se estructuró un protocolo que será de gran utilidad para evaluar la actividad oxidante o prooxidante de sustancias exógenas en investigaciones que lo requieran, este protocolo también podrá ser empleado para el tamizaje in vitro de sustancias antioxidantes.