Estandarización de protocolo para la obtención de mastocitos provenientes de pulpa dental humana para su caracterización por citometría de flujo

Abstract

La metodología empleada por estudios que han analizado la presencia del mastocito en pulpa ha sido parcial, ya que solo se han enfocado en el marcaje de sus moléculas de superficie en inmunohistoquímica. La citometría de flujo podría ser el método ideal ya que conjuga el uso de marcadores de superficie y funcionales de manera simultánea, para lograr identificar esta célula. Objetivo: Estandarizar un método de obtención de poblaciones de mastocitos provenientes de pulpas dentales humanas para su caracterización por citometría de flujo. Metodología: En este estudio descriptivo de corte transversal se obtuvieron 12 muestras de dientes con pulpitis irreversible asintomática de pacientes sistémicamente sanos entre los 18 y 40 años. Mediante dos métodos, no enzimático y enzimático. Respecto a los métodos enzimáticos restantes, se empleó el mismo protocolo de sección mecánica; se realizaron lavados con PBS 1X y ciclos de centrifugación a 400 gravedades durante 5min, para adición del coctel enzimático para digestión de la muestra: 1) Colagenasa IV y Dispasa I, o 2) Colagenasa IV, Tripsina y EDTA. Se realizó incubación overnight y se detuvo reacción enzimática SFB para conteo celular, ajuste y marcaje con mix de anticuerpos (Anti-tryptase, Anti-Chemase, Anti-CD117), se llevó a refrigeración a una temperatura de 4°C/30 min, se centrifugó y se retiró sobrenadante para resuspensión en 500uL de PBS para lectura en citómetro de flujo. Resultados: El porcentaje de células quimasa positivas fue de un 2,6%, 25% triptasa positivas y 3.7% CD117 positivas en sus gates correspondientes. El porcentaje de células doble positivas para quimasa y triptasa fue del 8,9% de la población y un 2% de doble positivas para CD117 y triptasa. Conclusiones: El protocolo con la solución enzimática 2 es aplicable para la obtención y caracterización del mastocito en pulpa dental humana con rasgos clínicos de inflamación. Esto proporcionará una herramienta para futuros estudios sobre el mastocito, su papel en procesos inflamatorios pulpares y enfoque terapéutico.