Estudio de la interacción hospedante-patógeno entre el Mal de Río Cuarto virus (MRCV) y el delfácido transmisor Delphacodes kuscheli

Abstract

El virus del Mal de Río Cuarto (MRCV, Reoviridae, Fijivirus) causa la principal enfermedad que afecta al maíz en la Argentina. Su genoma consiste en diez segmentos de ARN de doble cadena (S1 a S10) que codifican para un total de trece proteínas. El virus es transmitido de manera persistente y propagativa por insectos de la familia Delphacidae. Luego de adquirir el virus, sólo una pequeña proporción de los insectos vectores pueden transmitir la enfermedad al alimentarse de plantas sanas. Se desconocen aún las bases moleculares de la transmisión de MRCV y en general de las funciones que las proteínas virales cumplen durante la infección. Para establecer si existe una correlación entre la acumulación viral y la transmisión, se desarrolló un protocolo útil para la cuantificación de MRCV u otros ARN endógenos en insectos individuales mediante RT‐qPCR. Se optimizaron los pasos a seguir desde el almacenamiento de muestras hasta la cuantificación viral. Debido a que la técnica de RT‐qPCR requiere la previa validación de controles internos invariables en los tratamientos a estudiar, se seleccionaron, clonaron y secuenciaron 7 genes de mantenimiento del delfácido transmisor Delphacodes kuscheli y se evaluó la estabilidad de su expresión durante la infección con MRCV. Se determinó que, de los 7 genes estudiados, el gen de la ubiquitina es el más establemente expresado y por lo tanto adecuado para ser utilizado como control interno de referencia. La plataforma desarrollada no sólo permitirá la cuantificación precisa del título de MRCV en individuos D. kuscheli, sino que además abre el camino a futuros estudios del cambio en la expresión de genes endógenos de los insectos infectados con MRCV. Esto permitirá aportar datos moleculares para lograr una compresión más integral de la interacción MRCV‐delfácido vector. En paralelo, se decidió estudiar la función que cumplen las proteínas de MRCV durante la replicación viral en el insecto expresándolas en células Sf9 (de insecto no hospedante) y se analizó su localización subcelular por inmunofluorescencia y en células vivas. Se determinó que tanto las proteínas estructurales P3, P4 y P8 como la proteína no estructural P7‐1, se distribuyen en el núcleo y el citoplasma celular. Dado que el tamaño de estas proteínas excede el límite permitido por el complejo del poro nuclear, los resultados sugieren que las mismas serían transportadas activamente al núcleo celular. Asimismo, se observó que la proteína P5‐2 se localiza exclusivamente en el núcleo. Es posible que estas proteínas de MRCV capaces de ingresar al núcleo celular jueguen un rol en la regulación transcripcional de las células del hospedante. Se observó que la proteína P5‐1 posee una distribución citoplasmática heterogénea de aspecto granuloso y que dicha distribución se torna homogénea en ausencia del tripéptido carboxilo terminal TKF, el cual es un presunto motivo de unión a proteínas PDZ o de importación a peroxisomas. Por otro lado, se determinó que P6 forma grandes cúmulos perinucleares amorfos y es capaz de relocalizar parte de la tubulina celular a éstas formaciones. Esto sugiere un posible rol para P6 en la formación del material fibrilar que se observa en células de insecto y planta infectadas con MRCV. La proteína P9‐2 fue capaz de localizar en la membrana plasmática e indujo la formación de filopodios membranosos en la superficie de las células, por lo que esta proteína podría estar involucrada en el transporte del virus a través de la membrana durante la infección del insecto vector. Por su lado, la proteína de cápside externa P10 fue capaz de localizar en el retículo endoplasmático y de colocalizar completamente con tubulina, sugiriendo que el MRCV explota el sistema de secreción y el citoesqueleto de tubulina para el ensamblado y/o transporte viral. Finalmente, P9‐1 fue capaz de formar inclusiones citoplasmáticas conspicuas similares a cuerpos de inclusión virales (VIBs) o viroplasmas. A continuación, se utilizaron algunas combinaciones de fusiones fluorescentes de proteínas del MRCV para analizar su colocalización subcelular. No se logró observar colocalización entre la proteína P9‐2 y P5‐1, P7‐1, P7‐2, P9‐1 o P10. Tampoco se observó colocalización entre P9‐1 y P10 o P5‐2. Por otro lado, se determinó que P6 colocaliza con P10, P9‐1 y P7‐2, indicando que P6 podría cumplir algún rol en la formación del viroplasma y/o reclutamiento de otras proteínas a estas estructuras, así como en el movimiento intracelular de los viriones. Dado que la localización subcelular de P9‐1 es similar a la distribución característica de las proteínas mayoritarias de viroplasma de reovirus, decidimos estudiar más en profundidad sus propiedades funcionales y bioquímicas. Observamos que, al igual que otras proteínas mayoritarias de viroplasmas de reovirus, P9‐1 se auto asocia en complejos de alto peso molecular al ser expresada en bacterias, auto interacciona in vivo localizadamente en los cuerpos de inclusión que forma en células de insecto, tiene la capacidad de unir ácidos nucleicos de simple cadena, posee actividad ATPasa y alberga un dominio importante para la formación de cuerpos de inclusión en su mitad carboxilo terminal. Estos resultados indican que P9‐1 es el componente mayoritario de los viroplasmas y por lo tanto juega un rol fundamental en la replicación y ensamblado del MRCV en las células hospedantes.

Mal de Río Cuarto virus (MRCV, Reoviridae, Fijivirus) causes the most important maize disease in Argentina. Its genome consists of ten double‐stranded RNA segments (S1 to S10) that encode a total of thirteen proteins. The virus is persistently and propagatively transmitted by planthoppers of the family Delphacidae. Planthoppers acquire the virus by feeding on infected plants and after a 10 days latency period (during which the virus replicates and moves) a small proportion of them become infective and can transmit the virus to healthy plants. The molecular basis of the transmission and the general function of MRCV proteins during infection are still unknown. To establish whether the differences in transmission between individuals are due to differences in viral accumulation, a protocol useful for quantification of MRCV or endogenous RNAs in individual insects by RT‐qPCR was developed. The protocol steps, from the sample storage to the viral quantification were optimized. Since the RT‐qPCR technique requires the previous validation of invariable internal controls in the studied conditions, 7 housekeeping genes from the planthopper vector Delphacodes kuscheli were selected, cloned, sequenced and evaluated for their expression stability during MRCV infection. Out of the 7 studied genes, the polyubiquitin gene was the most stably expressed and consequently the most reliable as a reference internal control. The platform developed along this work will be useful for the precise quantification of MRCV titers in individual D. kuscheli insects as well as for future gene expression studies in MRCV infected delphacids. In parallel, we studied the role of MRCV proteins during the insect viral infection by expressing them in Sf9 non‐host insect cells and analyzing their subcellular localization by immunofluorescence and live imaging. We determined that the structural proteins P3, P4, and P8, and the non‐structural protein P7‐1, are distributed in the nucleus and cytoplasm. Because the size of these proteins exceeds the limits allowed by the nuclear pore complex, the results suggests that they are actively transported to the cell nucleus. Likewise, we observed that P5‐2 is located exclusively in the nucleus. Those MRCV proteins able to enter the cellular nucleus may perhaps be involved in transcriptional regulation of the host genes. We also observed that P5‐1 displays a heterogeneous granular cytoplasmic distribution that turns into a homogeneous localization when the C‐terminal tripeptide TKF, which in turn is a putative PDZ protein interaction motif and/or a peroxisomal import motif, is absent. On the other hand, it was shown that P6 accumulates in big amorphous perinuclear inclusions, being able to relocalize some of the cellular tubulin to these structures. This suggests that P6 might be involved in the formation of the fibrillar material observed in MRCV‐infected insect and plant cells. The P9‐2 protein was able to localize to the plasma membrane of cells and induced the formation of superficial filopodia‐like formations, suggesting that this protein might be involved in the viral transport across the plasma membrane during the insect vector cells infection. The putative outer capsid protein P10 was located in the endoplasmic reticulum and completely co‐localized with tubulin, suggesting that MRCV might also exploit the secretion pathway and the microtubules cytoskeleton for assembly and/or viral transport. Finally, P9‐1 was able to form conspicuous cytoplasmic VIB‐like structures. Next, some of the fluorescent fusions of MRCV proteins were used to analyze its subcellular co‐localization. We could not observe co‐localization between P9‐2 and P5‐1, P7‐1, P7‐2, P9‐1 or P10. Similarly, co‐localization of P9‐1 with P10 or P5‐2 was not detected. On the other hand, we showed that P6 co‐localize with P10, P9‐1 and P7‐2, which suggests that P6 might play a role in viroplasm formation and/or recruitment of other proteins to this structure as well as in the viral intracellular movement. Given that P9‐1 subcellular localization is similar to the distribution characteristically displayed by reovirus major viroplasm proteins, we carried out a more comprehensive study of its functional and biochemical properties. We observed that, like other reoviral major viroplasm proteins, P9‐1 self‐associates to form high molecular weight complexes when expressed in bacteria, displays a localized in vivo self‐interaction in the inclusion bodies formed in insect cells, has the ability to bind single stranded nucleic acids, has ATPase activity and contains an important domain for the formation of inclusion bodies at its C‐terminal half. These results suggest that P9‐1 is the major component of viroplasms, and thus plays a fundamental role in MRCV replication and assembly during the infection of host cells.