Validação de um protocolo de nested PCR em tempo real em um tubo e sequenciamento genético para detecção e caracterização de espécies e genótipos de Cryptosporidium em amostras fecais de aves

Abstract

Protozoários do gênero Cryptosporidium infectam o trato gastrintestinal e, ocasionalmente, os tratos respiratório, biliar e urinário, causando doença clínica e subclínica em aves. O diagnóstico espécie-específico da criptosporidiose é comumente realizado pela nested PCR convencional seguida de sequenciamento genético. O objetivo deste trabalho foi validar um protocolo de nested PCR em tempo real em um tubo (nPCR-TR-1T) seguida da análise da curva de dissociação e de sequenciamento genético para detectar e caracterizar as espécies e genótipos de Cryptosporidium em aves. A reação foi padronizada com utilização do SsoFast® EvaGreen Supermix (Bio-Rad) e do equipamento para PCR em tempo real CFX96 (Bio-Rad). Um total de 443 amostras de DNA genômico de aves foi analisado pela nested PCR convencional e pela nPCR-TR-1. Após a validação, a nPCR-TR-1T foi utilizada para determinar a ocorrência de Cryptosporidium spp. em frangos de corte em 64 núcleos comerciais de frangos de corte (NCFC) na região oeste do estado de Santa Catarina. Pela nested PCR convencional, foi observada positividade para Cryptosporidium spp. em 36/443 (8,1%), em contraste com a nPCR-TR-1T, que apresentou 90/443 (20,3%) amostras positivas para Cryptosporidium spp. O teste de sensibilidade analítica mostrou que a nPCR-TR-1T detecta aproximadamente 0,5 oocisto (2 esporozoítos) por reação. A avaliação da especificidade analítica não revelou amplificação de microrganismos que comumente apresentam amplificação inespecífica com primers utilizados para diagnóstico de Cryptosporidium spp. O cálculo da repetibilidade evidenciou o mesmo resultado em 27 de 30 amostras (90%). Em relação à reprodutibilidade da nPCR-TR-1T, foi observado o mesmo resultado em 24 das 30 amostras examinadas (80%). Foi possível realizar o sequenciamento em todas as 90 amostras amplificadas pela nPCR-TR-1T. As seguintes espécies foram identificadas: C. baileyi, C. galli, C. meleagridis, C. proventriculi e Cryptosporidium genótipo I em aves. O sequenciamento dos fragmentos amplificados pela nested PCR convencional foi possível em 10/38 (26,3%) das amostras positivas, com identificação das mesmas espécies identificadas pela nPCR-TR-1T. A ocorrência observada nos NCFC foi de 0,2% (1/64), com identificação de C. baileyi em uma amostra. Os resultados observados demonstram que a nPCR-TR-1T, em comparação com a nested PCR convencional, apresenta mais rapidez para obtenção dos resultados, menor possibilidade de contaminação com produtos amplificados e menor consumo de reagentes, pois ela é realizada em somente uma etapa e os resultados são obtidos em tempo real, sem necessidade de eletroforese em gel de agarose.

Protozoa of the genus Cryptosporidium infect the gastrointestinal tract and occasionally the respiratory, biliary, and urinary tracts, causing clinical and subclinical disease in birds. Species-specific diagnosis of cryptosporidiosis is commonly performed by conventional nested PCR followed by genetic sequencing. The objective of this study was to validate a one-tube real-time nested PCR protocol followed by melting curve analysis and genetic sequencing to detect and characterize Cryptosporidium species and genotypes in birds. The reaction was standardized using the SsoFast® EvaGreen Supermix (Bio-Rad) and the CFX96 real-time PCR system (Bio-Rad). A total of 443 avian genomic DNA samples were analyzed by conventional nested PCR and one-tube nested real-time PCR. After validation one-tube real-time nested PCR was used to determine the prevalence of Cryptosporidium spp. in 64 commercial broiler flocks in the western region of the state of Santa Catarina. By conventional nested PCR, 36/443 (8.1%) samples were positive for Cryptosporidium spp. In contrast, one-tube nested real-time PCR showed 90/443 (20.3%) positive samples for Cryptosporidium spp. The analytical sensitivity test showed that one-tube nested real-time PCR detects approximately 0.5 oocyst (2 sporozoites) per reaction. Analytical specificity evaluation did not reveal amplification of microorganisms that commonly present nonspecific amplification with primers used for the diagnosis of Cryptosporidium spp. The repeatability calculation showed the same result in 27 out of 30 samples (90%). Regarding the reproducibility of nPCR-TR-1T, the same result was observed in 24 of the 30 samples examined (80%). It was possible to perform sequencing on all 90 samples amplified by one-tube real-time nested PCR. The following species were identified: C. baileyi, C. galli, C. meleagridis, C. proventriculi, and Cryptosporidium genotype I in birds. Genetic sequencing of conventional nested PCR amplicons was possible in 10/36 (27.8%) of positive samples, with identification of the same species identified by one-tube real-time nested PCR. Cryptosporidium spp. prevalence in broiler flocks was 0.2% (1/64), with identification of C. baileyi in one sample. The results of this study demonstrated that one-tube nested real-time PCR, in comparison with conventional nested PCR, presents faster results, less possibility of contamination with amplicons, and lower consumption of reagents, since it is performed in only one step and the results are obtained in real time, without the need for agarose gel electrophoresis.