Estudo do potencial antioxidante e antiglicação de Siolmatra brasiliensis (cogn.) Baill. em sistema-modelo de estresse glico-oxidativo in vitro em soro sanguíneo

Abstract

O diabetes mellitus é uma síndrome metabólica caracterizada por deficiência na produção e/ou ações da insulina, culminando em hiperglicemia crônica, a qual encontra-se associada ao desenvolvimento das complicações diabéticas. A hiperglicemia contribui para os processos de glicação proteica e de formação dos produtos finais de glicação avançada (AGEs). Dentre as substâncias que contribuem para a formação dos AGEs, destacam-se os compostos dicarbonílicos, incluindo o metilglioxal. O metilglioxal (MGO) é capaz de reagir com resíduos de aminoácidos em proteínas presentes em domínios funcionais, culminando em perda de função. Sistemas-modelo de modificações glico-oxidativas in vitro mimetizam os impactos negativos da hiperglicemia sobre biomoléculas. A maioria dos estudos que empregam sistemas-modelo de glicação in vitro utilizam proteínas isoladas, poucos são os estudos com matrizes complexas, incluindo o soro sanguíneo humano. Estudos são necessários para padronização de sistemas-modelo de modificações glico-oxidativas in vitro com soro sanguíneo humano, com vistas em sua utilização para o screening de compostos bioativos ou preparações com potencial antiglicação e/ou anti-AGE. Estudos têm demonstrado a atividade antidiabética de preparações do caule de Siolmatra brasiliensis (Cogn.) Bail, uma espécie nativa do Cerrado e Pantanal brasileiros. Recentemente, demonstrou-se que preparações dessa planta também possuem atividade antiglicação, pois foi capaz de diminuir marcadores do estresse glico-oxidativo em sistema-modelo de glicação proteica in vitro (albumina sérica bovina incubada com glicose). O objetivo deste estudo foi avaliar as alterações em biomarcadores do estresse glico-oxidativo em sistema-modelo de modificações glico-oxidativas in vitro em soro sanguíneo humano, incubado na presença de metilglioxal, e na ausência ou presença de extrato hidroetanólico ou fração clorofórmica ou fração acetato de etila do caule de Siolmatra brasiliensis, ou de substância isolada, a naringenina. Foram realizados quatro experimentos utilizando amostras de soro controle de origem humana: (I) sistema-modelo de glicação in vitro na presença de glicose, no qual o soro sanguíneo humano foi incubado a 37ºC por 40 dias, e avaliadas as atividades de enzimas antioxidantes (catalase e paraoxonase), níveis de biomarcadores de peroxidação lipídica (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico), níveis dos grupos carbonilas em proteínas, estimativa de AGEs fluorescentes e estudo de modificações estruturais em proteínas; (II) sistema-modelo de modificações glico-oxidativas in vitro na presença de MGO, para padronização da melhor concentração de MGO a ser utilizada, no qual soro sanguíneo humano foi incubado a 37ºC por 48 horas na presença de MGO nas concentrações de 5, 10 e 20 mM, e em diferentes tempos monitorou-se os AGEs fluorescentes e a presença de modificações estruturais em proteínas; (III) sistema-modelo de modificações glico-oxidativas in vitro na presença de MGO e avaliação dos efeitos do extrato, fração e substância isolada de caule de Siolmatra brasiliensis, no qual soro sanguíneo humano foi incubado a 37ºC por 48 horas na presença de 10 mM de MGO, e na ausência ou presença de distintas concentrações de extrato hidroetanólico (SbExt) ou fração clorofórmica (SbCHCl3) do caule de Siolmatra brasiliensis, ou de substância isolada, a naringenina (NAR); em diferentes tempos foram monitorados os níveis de diversos marcadores bioquímicos, formação de AGEs fluorescentes, formação de produtos de oxidação dos resíduos de triptofano e tirosina, níveis de grupos carbonil em proteínas (PCO), análise de modificações estruturais em proteínas e as atividades arilesterase e lactonase da paraoxonase 1. (IV) sistema-modelo de modificações glico-oxidativas in vitro na presença de MGO e avaliação dos efeitos da fração acetato de etila do caule de Siolmatra brasiliensis, no qual soro sanguíneo humano foi incubado a 37ºC por 48 horas na presença de 10 mM de MGO, e na ausência ou presença de distintas concentrações da fração acetato de etila (SbAcE) do caule de Siolmatra brasiliensis; em diferentes tempos foram monitorados os níveis de diversos marcadores bioquímicos, formação de AGEs fluorescentes, formação de produtos de oxidação dos resíduos de triptofano e tirosina, níveis de grupos carbonil em proteínas (PCO), análise de modificações estruturais em proteínas e atividades arilesterase e lactonase de paraoxonase 1. Em (I) foi possível observar aumento gradual na intensidade de fluorescência dos AGEs, modificações na estrutura de proteínas, aumento progressivo nos níveis de PCO no decorrer do tempo de incubação de soro na presença de glicose, as quais foram atenuadas na presença de aminoguanidina (agente protótipo anti-AGE). Em (II) o sistema-modelo de modificações glico-oxidativas in vitro contendo soro + MGO apresentou perfil de resposta de concentração dependente na geração de AGEs fluorescentes e modificações na estrutura de proteínas. Em (III e IV) SbExt, NAR e SbAcE foram capazes de diminuir a formação de AGEs nas incubações contendo soro + MGO, bem como também diminuíram a formação dos produtos de oxidação dos resíduos de triptofano e tirosina, enquanto SbCHCl3 não foi eficiente. Na análise de modificações do padrão de separação eletroforetica de proteínas em soro + MGO, SbExt, SbCHCl3, NAR e SbAcE não se mostraram eficazes, bem como nas atividades arilesterase e lactonase de PON 1. Neste estudo foi possível observar que, o sistema-modelo de glicação in vitro de soro sanguíneo na presença de metilglioxal é mais severo em comparação ao sistema-modelo na presença de glicose. O extrato hidroetanólico de caule de Siolmatra brasiliensis e narigenina, uma das substâncias isoladas a partir dessa espécie, bem como o a fração acetato de etila, parecem atenuar eventos glico-oxidativos que ocorrem em fases mais avançadas.

Diabetes mellitus is a metabolic syndrome characterized by deficiency in the production and/or action of insulin, culminating in chronic hyperglycemia, which is associated with the onset of the diabetic complications. Hyperglycemia contributes to protein glycation processes and formation of advanced glycation end products (AGEs). Among the compounds that contribute to the formation of AGEs, it can be cited the dicarbonyl compounds, including methylglioxal. Methylglioxal (MGO) is able to react with amino acid residues in proteins found into functional domains, leading to loss of function. In vitro model systems of glycoxidative changes mimic the negative impacts of hyperglycemia on biomolecules. Most studies using in vitro model systems of glycation use isolated proteins, few studies use complex matrices, such as human blood serum. Studies are necessary for standardization of in vitro model systems of glycoxidative changes with human blood serum, atempting to use them for the screening of bioactive compounds or preparations having antiglycation and/or anti-AGE potential. Studies have demonstrated the antidiabetic activity of preparations of stem from Siolmatra brasiliensis (Cogn.) Bail, a native species of the Brazilian Cerrado and Pantanal. Recently, it has been demonstrated that preparations of this plant also possess antiglycation activity, since they decreased markers of glycoxidative stress in an in vitro model system of protein glycation (bovine serum albumin incubated with glucose). The aim of this study was to evaluate changes in glycoxidative stress biomarkers in an in vitro model system of glycoxidative changes in human blood serum, incubated in the presence of methylglioxal, and in absence or presence of the hydroethanolic extract or chloroform fraction or ethyl acetate fraction of the stem of Siolmatra brasiliensis, or in the presence of na isolated substance, naringenin. Four experiments were performed using human serum samples: (I) in vitro model system of glycation in the presence of glucose, in which human blood serum was incubated at 37ºC for 40 days, and it was evaluated the activities of the antioxidant enzymes (catalase and paraoxonase), biomarkers of lipid peroxidation (thiobarbituric acid reactive substances), levels of carbonyl content in proteins, estimation of fluorescent AGEs and analysis of structural changes in proteins; (II) in vitro model system of glycoxidative changes in the presence of MGO, to standardize the best concentration of MGO to be used, in which human blood serum was incubated at 37ºC for 48 hours in the presence of MGO at concentrations of 5, 10 and 20 mM, for monitoring fluorescent AGEs structural changes in proteins; (III) in vitro model system of glycoxidative changes in the presence of MGO and evaluation of the effects of the extract, fraction and isolated substance from Siolmatra brasiliensis stem, in which human blood serum was incubated at 37ºC for 48 hours in presence of 10 mM MGO, and in absence or presence of different concentrations of the hydroethanolic extract (SbExt), chloroform fraction (SbCHCl3) of the stem of Siolmatra brasiliensis, or isolated substance, naringenin (NAR); at different times, the following analysis were performed: levels of several biochemical markers, formation of fluorescent AGEs, formation of oxidation products of tryptophan and tyrosine residues, levels of carbonyl content in proteins (PCO), analysis of the structural changes in proteins, and arilesterase and lactonase activities of paraoxonase 1. (IV) in vitro model system of glycoxidative changes in the presence of MGO and evaluation of the effects of the ethyl acetate fraction from Siolmatra brasiliensis stem, human blood serum was incubated at 37ºC for 48 hours in presence of 10 mM MGO, and in absence or presence of different concentrations of the ethyl acetate fraction (SbAcE) of the stem of Siolmatra brasiliensis; at different times, the following analysis were performed: the levels of several biochemical markers, formation of fluorescent AGEs, formation of oxidation products of tryptophan and tyrosine residues, levels of carbonyl content in proteins (PCO), analysis of the structural changes in proteins, and arilesterase and lactonase activities of paraoxonase 1. In (I) it was possible to observe a gradual increase in the fluorescence intensity of AGEs, changes in the protein structures, progressive increase in PCO levels during the incubation time of serum in the presence of glucose, which were attenuated in the presence of aminoguanidine (anti-AGE prototype agent). In (II) the in vitro model system of glycoxidative changes showed a concentration dependent profile related to the formation of fluorescent AGEs and promotion of changes in protein structures. In (III and IV) SbExt, NAR and SbAcE were able to decrease the AGEs formation in incubations having serum + MGO, as well as decreased the formation of oxidation products of tryptophan and tyrosine residues, while SbCHCl3 was not efficient. In the analysis of the changes in the electrophoretic separation pattern of proteins from serum + MGO, SbExt, SbCHCl3, NAR and SbAcE were not effective, either with enzymatic activities of PON 1 (arylesterase and lactonase). Conclusion: In this study, it was possible to observe that, compared to the in vitro model system of glycation with blood serum + MGO is more aggressive than model system with blood serum + glucose. The hydroethanolic extract of Siolmatra brasiliensis and narigenin, one of the substances isolated from this species, either ethyl acetate fraction seem to attenuate glycoxidative events that occur in more advanced phases.