Proteômica de tecido ruminal e cecal de bovinos Nelore confinados com diferentes estratégias nutricionais

Abstract

A literatura apresenta poucos estudos que investigaram o proteoma de ceco e rúmen de bovinos submetidos a estratégias alimentares com uso de aditivos. Essa proposta é pioneira na identificação, expressão e compreensão do perfil proteico ruminal e cecal de bovinos nelore confinados. Artigo 1: Objetivou-se avaliar a expressão proteica, a fim identificar possíveis moléculas candidatas a biomarcadores e suas relações com funções metabólicas e nutricionais aplicados a animais confinados com diferentes níveis de amido (25, 35 e 45%) e aditivos (Monensina × blend de óleos essências + amilase exógena), as dosagens de monensina sódica, blend de óleos essenciais e amilase exógena foram 26, 90 e 560 mg/kg MS, respectivamente. Foram utilizados machos Nelore (n = 210) (Bos taurus indicus), não castrados (Peso Inicial = ± 380 kg). Após o abate foram coletadas amostras de ceco e acondicionadas imediatamente em nitrogênio líquido. Foi feito um pool de amostras utilizando 90 animais (15 animais/tratamento) no processo de precipitação do pellet proteico. A separação e caracterização do proteoma das amostras biológicas foram feitas por eletroforese bidimensional (2D-PAGE) e identificadas por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS). Os géis de poliacrilamida foram analisados utilizando ImageMaster 2D Platinum 7.0 para verificar as diferenças na expressão de proteínas, para as comparações do % volume normalizado dos spots. Após a identificação das proteínas foram analisadas as vias metabólicas usando a função da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG), análise de enriquecimento da via Reactome para mapear as expressões das proteínas que codificam enzimas e suas respectivas funções nas vias afetadas. O uso de Blend de Óleo essenciais associado com α-Amilase como aditivo alimentar promoveu maior expressão de enzimas na via da glicólise e gliconeogênese e ausência de proteína ligada a inflamação (Leukocyte elastase inhibitor). Por outro lado, o incremento de amido nas dietas promoveu redução de enzimas ligadas a degradação de carboidrato com aumento de respostas atribuídas à injúrias inflamatórias no rúmen de bovinos Nelore confinados. Artigo 2: Objetivou-se mapear o proteoma do epitélio ruminal de bovinos nelore confinados (n=60) com diferentes níveis de amido (Baixo: 25 e Alto: 45%) e aditivos (Monensina × blend de óleos essências + amilase exógena). As separações e fracionamento das proteínas foram através da eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D-PAGE), e posteriormente a identificação por espectrometria de massas acoplada a cromatografia líquida (LC-MS/MS). Após a identificação das proteínas foram utilizados os acessos das proteínas para a classificação em suas funções moleculares, processos biológicos e componentes celulares utilizando Blast2GO, posteriormente a análise de enriquecimento via String para mapear as redes e interação entres proteínas caracterizadas suas respectivas funções no metabolismo de glicose e ácidos graxos. Dietas contendo blend de óleos essenciais associados à amilase exógena promoveram maior expressão de macromoléculas que participam da degradação de carboidratos pela via glicolítica e cetogênica. Foram identificadas 14 proteínas com maior expressão e presentes no tecido epitelial do rúmen envolvidas na oxidação da glicose, a proteína hidroximetilglutaril-CoA liase que catalisa parte do metabolismo metabólico intermediário, uma etapa fundamental na cetogênese. Nossos resultados sugerem que houve aumento da glicólise a partir da oxidação do gliceraldeído-3-fosfato, que participa da primeira etapa da produção de acetato e butirato e da descarboxilação oxidativa no epitélio ruminal de bovinos nelore confinados. A monensina melhora os precursores de propionato, a maior expressão de metilmalonil-CoA mutase sugere síntese de propionato via propionil-CoA que participa do ciclo do ácido cítrico através do succinil-CoA, que pode aumentar a energia metabolizável e reduzir a ingestão de alimentos.

Few studies have investigated the proteome of cecum and rumen of cattle feeding different strategies with the use of additives. This proposal is a pioneer in the identification, expression and understanding of the ruminal and cecal protein profile of feedlot Nellore cattle. Manuscript 1: The objective was to evaluate protein expression in order to identify possible candidate molecules for biomarkers and their relationships with metabolic and nutritional functions applied to animals fed with different levels of starch (25, 35 and 45%) and additives (Monensin × blend of essential oils + exogenous amylase), the dosages of sodium monensin, blend of essential oils and exogenous amylase were 26, 90 and 560 mg/kg DM, respectively. Nellore bulls (n = 210) (Bos taurus indicus) (initial weight = ± 380 kg) were used. After slaughter, cecum samples were collected and immediately placed in liquid nitrogen. Samples were pooled using 90 animals (15 animals/treatment) in the protein pellet precipitation process. The separation and characterization of the proteome of biological samples were performed by twodimensional electrophoresis (2D-PAGE) and identified by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS). Polyacrylamide gels were analyzed using ImageMaster 2D Platinum 7.0 to verify differences in protein expression for the % volume normalized spot comparisons. After identifying the proteins, the metabolic pathways were analyzed using the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) function, enrichment analysis of the Reactome pathway to map the expressions of proteins encoding enzymes and their respective functions in the affected pathways. The use of blend essential oil associated with α-Amylase as a feedd additive promoted greater expression of enzymes in the glycolysis and gluconeogenesis pathway and absence of protein linked to inflammation (Leukocyte elastase inhibitor). On the other hand, the increase in starch in the diets reduced enzymes linked to carbohydrate degradation with increased responses attributed to inflammatory injuries in the rumen of feedlot Nellore cattle. Manuscript 2: The objective was to map the proteome of the ruminal epithelium of feedlot Nellore cattle (n=60) with different levels of starch (Low: 25 and High: 45%) and additives (Monensin × blend of essential oils + exogenous amylase) the dosages of sodium monensin, blend of essential oils and exogenous amylase were 26, 90 and 560 mg/kg DM, respectively. Protein separations were performed using two-dimensional polyacrylamide gel electrophores (2D-PAGE), followed by identification by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS). After protein identification, protein accessions were used to classify their molecular functions, biological processes and cellular component using Blast2GO, then enrichment analysis pathways String to map the networks and interaction between proteins characterized and their respective functions in glucose and fatty acids metabolic. Diets containing blend of essential oils associated with exogenous amylase promoted greater expression of macromolecules that participate in carbohydrate degradation via glycolytic and ketogenic pathways. We identified 14 proteins with greater expression and present in the epithelial tissue of the rumen involved in glucose oxidation, the protein hydroxymethylglutaryl-CoA lyase that catalyzes part of intermediary metabolic metabolism, a fundamental step in ketogenesis. Our results suggest that there was an increase in glycolysis from the oxidation of glyceraldehyde-3-phosphate, which participates in the first stage of acetate and butyrate production and oxidative decarboxylation in the ruminal epithelium of feedlot Nellore cattle. Monensin improves propionate precursors, the increased expression of methylmalonyl-CoA mutase suggests propionate synthesis via propionyl-CoA that participates in the citric acid cycle through succinyl-CoA, which can increase metabolizable energy and reduce feed intake.