Currently, the double staining method for bone and cartilaginous staining using alizarin red and cyan blue, respectively, generates high costs in the implementation of protocols for anatomy and systematic studies in vertebrates. The objective of this work was to compare and analyze the dye extracted from Bixa Orellana seeds and the alizarin red used in bone staining in Piaractus Brachypomus juvenile fish. 70 juvenile fish with 2 ± 0.4 cm total length were used; they were sedated using 2-phenoxiethanol at a final concentration of 500 mg/L and slaughtered under the standards and procedures for laboratory animals. They subsequently underwent a series of tissue conservation phases. 35 fish were allocated to each treatment (alizarin red and annatto) and bone structures stained with each dye were observed and identified. IE (intensity of emerging light) and ID (integral density) were also analyzed in diaphanization specimens for each treatment. No significant differences were observed for IE (P = 0.10), in contrast to the ID (p < 0.05) for the vertebral column and dorsal fin. In conclusion Bixa Orellana (annatto) has dying affinity in bone structures of juvenile fish and is therefore a good alternative for the diaphanization technique and osteological studies of vertebrates at a low cost.Actualmente el método de doble tinción empleado con rojo de alizarina y azul de alcian para tinción ósea y cartilaginosa, respectivamente, genera costos elevados en la realización de protocolos para estudios de anatomía y sistemática en vertebrados. El objetivo del presente trabajo fue comparar y analizar el colorante extraído de semillas de Bixa orellana con el rojo de alizarina en la tinción ósea en peces juveniles de Piaractus brachypomus. Se utilizaron 70 peces juveniles de 2 ± 0,4 cm de longitud total, los cuales fueron sedados utilizando 2 Fenoxi-etanol a concentración final de 500 mg/L y sacrificados en conformidad con las normas y procedimientos para el uso de animales de laboratorio. Posteriormente, se sometieron a una serie de fases para la conservación del tejido. Se distribuyeron 35 peces para cada tratamiento (rojo de alizarina y achiote) y se observaron e identificaron las estructuras óseas teñidas con cada uno de los colorantes. Además, se analizó la IE (intensidad de luz emergente) y DI (Densidad integral) en ejemplares diafanizados para cada tratamiento. No se observaron diferencias significativas para la IE (P = 0,10), a diferencia de la DI (p < 0,05) para columna vertebral y aleta dorsal. Concluimos que el colorante de Bixa orellana (achiote) presenta afinidad en estructuras óseas de peces juveniles y, por tanto, es una buena alternativa para la realización de la técnica de diafanización y estudios osteológicos de vertebrados a bajo costo.Atualmente o método de dupla coloração empregado com vermelho de alizarina e azul de Alcian para coloração óssea e cartilaginosa, respectivamente, gera custos elevados na realização de protocolos para estudos de anatomia e sistemática em vertebrados. O objetivo do presente trabalho foi comparar e analisar o colorante extraído de sementes de Bixa orellana com o vermelho de alizarina na coloração óssea em peixes juvenis de Piaractus brachypomus. Utilizaram-se 70 peixes juvenis de 2 ± 0,4 cm de longitude total, os quais foram sedados utilizando 2 Fenoxietanol com a concentração final de 500 mg/L e sacrificados em conformidade com as normas e procedimentos para o uso de animais de laboratório. Posteriormente, submeteram-se a uma série de fases para a conservação do tecido. Distribuíram-se 35 peixes para cada tratamento (vermelho de alizarina e de urucum) e observaram-se e identificaram as estruturas ósseas tingidas com cada um dos colorantes. Além disso, analisou-se a IE (intensidade de luz emergente) e DI (Densidade integral) em exemplares diafanizados para cada tratamento. Não se observaram diferenças significativas para a IE (P = 0,10), diferente da DI (p < 0,05) para coluna vertebral e barbatana dorsal. Concluímos que o colorante de Bixa orellana (urucum) apresenta afinidade em estruturas ósseas de peixes juvenis e, portanto, é uma boa alternativa para a realização da técnica de diafanização e estudos osteológicos de vertebrados a baixo custo.