Uma estratégia de fracionamento celular para obtenção das frações citoplasmática, nuclear e mitocondrial em uma mesma preparação cerebral

Abstract

A técnica de fracionamento celular é muito utilizada em pesquisas biológicas, possibilitando o mapeamento da localização e tráfego de proteínas celulares. A preparação de frações celulares de tecidos e em modelos de cultura celular permite o enriquecimento de componentes celulares, e por conseguinte, o seu estudo de forma isolada, sem a interferência das outras partes. O uso de centrifugações de forma progressiva, permite a separação do citoplasma e de diferentes organelas. Esta técnica de centrifugação diferencial permite identificar a localização de certos componentes celulares, analisando a função e o tráfego de proteínas entre os mais diversos compartimentos celulares. Não encontramos na literatura um método de fácil execução que permitisse a separação simultânea de citoplasma, núcleo e mitocôndria em preparações de estruturas cerebrais de camundongo (córtex e hipocampo). Neste trabalho, foi descrito um método de fracionamento celular por centrifugação, nomeado REAP Plus, onde é possível obter as frações enriquecidas de citoplasma, núcleo e mitocôndria em uma mesma preparação. Esta técnica de separação foi validada para fatias de hipocampo e para extrato de córtex cerebral, sendo que a primeira possui uma quantidade de proteínas menor quando comparada com o córtex total. Para a validação da pureza das frações foi utilizada a análise de Western blot e a determinação da atividade de enzimas específicas para cada compartimento celular. Como esperado, a técnica de Western blot revelou que as proteínas peroxirredoxina 3 e citrato sintase foram marcadas intensamente na fração mitocondrial e lamina B na fração nuclear, validando o método. A atividade das enzimas citoplasmáticas (lactato desidrogenase e glicose-6-fosfato desidrogenase) e mitocondriais (succinato desidrogenase e citocromo c oxidase) foram de 4 a 27 vezes mais abundantes nos compartimentos correspondentes, também indicando a validade do método. Como conclusão, obtivemos um método eficiente, rápido e de baixo custo que permite um bom enriquecimento das frações de citoplasma, núcleo e mitocôndria em amostras de fatias de hipocampo e córtex cerebral.

The cell fractionation technique is widely used in biological research, making it possible to map the location and traffic of cellular proteins. The preparation of cell fractions of tissues and in cell culture models allows the enrichment of cell components, and therefore, their study in isolation, without the interference of other parts. The progressive use of centrifugal force allows the separation of the cytoplasm and different organelles. This differential centrifugation technique allows the identification of the location of certain cellular components, analyzing the function and the traffic of proteins between the most diverse cellular compartments. We did not find in the literature a method of easy execution that would allow the simultaneous separation of cytoplasm, nucleus and mitochondria in preparations of brain structures of mice (cortex and hippocampus). In this work, a method of cell fractionation by centrifugation, named REAP Plus was described, where it is possible to obtain enriched fractions of cytoplasm, nucleus and mitochondria in the same preparation. This separation technique was validated for hippocampal slices and for extract of cerebral cortex, with the first having less total protein when compared to the total cortex. Western blot analysis and determination of specific enzyme activity for each cell compartment was used to validate the purity of the fractions. As expected, the Western blot technique revealed that the peroxiredoxin 3 and citrate synthase proteins were marked intensely in the mitochondrial fraction and lamina B in the nuclear fraction validating the method. The activity of cytoplasmic enzymes (lactate dehydrogenase and glucose-6-phosphate dehydrogenase) and mitochondrial enzymes (succinate dehydrogenase and cytochrome c oxidase) were 4 to 27 times more abundant in the corresponding compartments, also indicating the validity of the method. As a conclusion, we obtained an efficient, fast and low cost method that allows enrichment of cytoplasmic, nuclear, and mitochondrial fractions in samples of slices of hippocampus and cerebral cortex.