Identificación molecular de especies de Cryptosporidium sp. de importancia zoonótica

Abstract

La criptosporidiosis es una zoonosis parasitaria causada por Cryptosporidium sp. que afecta a una gran variedad de vertebrados incluyendo al humano. Existen varias especies de Cryptosporidium que afectan al ganado bovino, las más frecuentes son C. parvum, C. bovis, C. rynae y C. andersoni. C. parvum es la principal especie de transmisión antropozoonótica y causa diarrea en los terneros menores de 2 meses de edad. Su transmisión es por vía fecal-oral mediante la ingesta de agua o alimentos contaminados con ooquistes. La detección del parásito en materia fecal se basa usualmente en la observación microscópica de ooquistes coloreados con tinciones ácido-alcohol resistentes. Sin embargo, esta metodología no permite identificar las especies de Cryptosporidium. Para tal fin se utilizan herramientas moleculares como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). El gen 18S de ARN ribosomal es el marcador mayormente utilizado en la identificación de especies de este parásito. Está presente en 5 copias distribuidas en el genoma parasitario y contiene regiones semiconservadas e hipervariables. La técnica de PCR anidada descrita en el año 1999 ha sido utilizada como método de referencia para la genotipificación de Cryptosporidium en la mayoría de los estudios. En Argentina la prevalencia de Cryptosporidium sp. en terneros de rodeos lecheros ha sido estimada en 16-29%, con un valor de 16% en el noreste de la provincia de Buenos Aires, donde se ubica el 33% de los establecimientos lecheros de la provincia de Buenos Aires y la especie más prevalente hallada ha sido C. parvum. Dada la importancia zoonótica de este parásito y la ausencia de estudios locales en el partido de Luján provincia de Buenos Aires, los objetivos del presente trabajo fueron: 1) Estimar la prevalencia de infección por Cryptosporidium sp. en rodeos de establecimientos lecheros pertenecientes al partido de Luján mediante detección microscópica y por biología molecular; 2) Identificar los factores epidemiológicos asociados a la transmisión de Cryptosporidium sp. en dichos establecimientos; 3) Caracterizar la especie de Cryptosporidium infectante en muestras de materia fecal de bovinos mediante la técnica de PCR y posterior secuenciación de los productos de amplificación. Para ello se recolectaron muestras de materia fecal de terneros Bos taurus, de la raza Holando Argentino en etapa de crianza de cuatro establecimientos lecheros del partido de Luján. Se realizaron encuestas epidemiológicas a los propietarios de los tambos con el fin de recabar datos acerca de las características generales de las guacheras, sistema de crianza, alimentación, sanidad y bienestar/confort animal. Para cada muestra se registró su consistencia (diarreica o normal) y la presencia o ausencia de sangre. Para estimar la prevalencia de infección por Cryptosporidium sp. se determinó la ausencia o presencia del parásito mediante la observación microscópica de ooquistes coloreados con la tinción de Kinyoun en frotis de materia fecal. Posteriormente se utilizó la técnica de PCR para la detección de un fragmento del gen que codifica para la subunidad menor 18S del ARN ribosomal de Cryptosporidium sp., optimizada en el presente trabajo de tesis en su formato touchdown. El producto de amplificación obtenido fue secuenciado a fin de determinar las especies de Cryptosporidium presentes. Se estimó la prevalencia y se realizó el análisis de asociación entre la infección y los factores epidemiológicos estudiados que sirvió de base para el posterior estudio de riesgo (Odds ratio). La información obtenida permitió realizar una regresión logística binaria a fin de describir el efecto de todas las variables en su conjunto. Se estimó una prevalencia general del 27%, observándose diferencias significativas (p= 0,024) cuando se compararon los valores obtenidos para cada establecimiento (6,25-60%). El análisis de riesgo demostró que las condiciones de manejo, el tipo de crianza, alimentación, así como las características particulares de la guachera representan factores epidemiológicos relevantes en la transmisión de la infección por Cryptosporidium. Mediante la técnica de PCR-touchdown se obtuvo un valor de prevalencia general de 16% sin diferencias significativas (p= 0,619) entre los establecimientos (6,3-22,2%). En los cuatro establecimientos se halló C. parvum de manera prevalente y en uno de los tambos también se detectó C. bovis. Este trabajo constituye el primer estudio epidemiológico de la infección por Cryptosporidium e identificación molecular de especies de este parásito en establecimientos lecheros del partido de Luján, provincia de Buenos Aires. El hallazgo de la especie zoonótica C. parvum junto con la identificación de factores relevantes que condicionan su transmisión, resultan fundamentales para diseñar estrategias de control capaces de mitigar y prevenir los efectos de la infección en rodeos lecheros del partido de Luján, evitar potenciales eventos de transmisión al ser humano y controlar la contaminación del medio ambiente con ooquistes.