RESUMEN Actualmente se conoce que las células madre embrionarias y adultas representá una fuente de células para ser empleadas en la medicina regenerativa. Sin embargo, a pesar de su potencial terapéutico ambos tipos de células tienen asociado ciertos problemas éticos que pueden limitar su disponibilidad y que están muy relacionados con su aplicación clínica (Evangelista y col., 2008). La membrana amniótica es la membrana extraembrionaria más interna de la placenta y consiste de una delgada, traslúcida y elástica membrana fetal que se encuentra en contacto directo con el líquido amniótico. Esta consta de tres capas: un epitelio simple de células cuboidales, una membrana basal y un estroma avascular (Toda y col., 2007; Niknejad y col., 2008; Mamede y col., 2012). En ella se ha señalado la existencia de dos poblaciones celulares que muestran algunas propiedades características de las células madre. Las células epiteliales amnióticas humanas o hAECs (Human Amnion Epithelial Cells), que derivan del ectodermo embrionario y las células mesenquimales del estroma o hAMSCs (Human Amnion Mesenchymal Stromal Cells), que derivan del mesodermo embrionario (Whittle y col, 2000; Díaz - Prado y col., 2011). Se ha demostrado que las células epiteliales amnióticas tienen la capacidad de diferenciarse hacia tejidos derivados de las tres capas germinales incluyendo endodermo, ectodermo y mesodermo (Díaz-Prado y col., 2011). Esto sugiere que, al igual que las células madre embrionarias, las células epiteliales amnióticas pueden ser una fuente de células madre útil para la terapia celular y la medicina regenerativa (Miki y Strom, 2006). La búsqueda de nuevas fuentes de donde extraer células madre sin complicaciones éticas y que se encuentren en gran cantidad, ha llevado al desarrollo de técnicas que permiten aislar, cultivar y caracterizar las células madre epiteliales extraídas de la membrana amniótica humana, la cual no acarrea problemas técnicos, éticos o morales ya que es un tejido extraembrionario de fácil acceso. Debido a que estas células son de fácil obtención, y a las ventajas que tienen en cuanto a su pluripotencia, baja inmunogenicidad y la falta de tumorigenicidad; las células madre derivadas del epitelio amniótico, pueden ser consideradas una fuente de células madre de gran utilidad en diversos campos de la bioingeniería y la terapia celular. En este contexto y en función de los proyectos de investigación relacionados a la bioingeniería tisular que se han venido desarrollando en el laboratorio (Merentes, 2009; Márquez y col., 2012) y considerando que en nuestro país son muy poco los estudios realizados con la membrana amniótica humana como fuente de obtención, se planteó el desarrollo de técnicas que permitieran el establecimiento de las condiciones óptimas para el aislamiento, mantenimiento, proliferación y caracterización de las células madre epiteliales de la membrana amniótica humana, evaluando si éstas células mantienen su funcionalidad y viabilidad bajo ciertas condiciones de cultivo. Además, se diseño un sistema de cultivo in vitro con el objetivo de evaluar el uso potencial de la membrana amniótica denudada y comparar la población de células epiteliales de la membrana amniótica humana, en base a sus características morfológicas, propiedades de adhesión y expresión de algunos marcadores característicos, cuando son cultivadas sobre el estroma avascular de la membrana amniótica humana como un biosustrato tridimensional, bajo la influencia de diferentes condiciones de criopreservación. El cultivo primario de las células epiteliales amnióticas se estableció de manera eficaz mediante la técnica de disgregación enzimática con la Dispasa, obteniéndose cultivos en monocapa donde se observó una heterogeneidad de célula constituido por 3 tipos principales de fenotipos celulares, en la que se pueden destacar células con morfología poligonal tipo epitelial, células con morfología fusiforme y células de amplio volumen citoplasmático. Las condiciones in vitro suministradas permitieron la adhesión, el mantenimiento y proliferación de las células epiteliales amnióticas, tanto en los cultivos como en los subcultivos, conservándose su fenotipo sin mostrar características asociadas a la senescencia. Mediante la caracterización inmunocitoquímica de los cultivos primarios y los subcultivos fue posible confirmar la presencia de células de naturaleza epitelial, indicado por la expresión de Pan-CK y E-cadherina, Por su parte los ensayos realizados con las células epiteliales amnióticas cultivadas sobre el estroma de la membrana amniótica humana en fresco, criopreservada con glicerol y vitrificada, presentaron diferencias en el patrón de adhesión y crecimiento de las células. Sin embargo, el hecho de que las células epiteliales cultivadas sobre el estroma amniótico en fresco y vitrificado tengan una buena adhesión y crecimiento, además del mantenimiento de la morfología expresando los marcadores epiteliales Pan-CK y E-cadherina, nos indica que el estroma amniótico es un biosustrato tridimensional con un gran potencial para ser utilizado en los cultivos celulares.TUTOR: Dra. Elizabeth Merentes Díaz