En Venezuela se han realizado investigaciones que evidencian la presencia de Ehrlichias en perros. El método de uso rutinario para el diagnóstico de la Ehrlichiosis Canina es el Frotis de Capa Blanca (FCB) teñido con coloraciones tipo Romanowski, pero debido a su baja sensibilidad y especificidad no ha permitido la identificación precisa de las diferentes especies que infectan al perro. La Inmunofluorescencia Indirecta es el método serológico más utilizado, útil para estudios epidemiológicos pero en nuestro país ha tenido un uso limitado debido a lo costoso que resulta la adquisición comercial del antígeno. Por otra parte, están ampliamente documentadas las reacciones serológicas cruzadas entre Ehrlichias pertenecientes a un mismo genogrupo, por lo tanto este método tampoco asegura la identificación de la especie Ehrlichial. Por estas razones, se llevó a cabo el presente trabajo con la finalidad de aislar en cultivo in vitro Ehrlichia sp. de células mononucleares de perros como también realizar la identificación ultraestructural y molecular mediante Microscopía Electrónica de Transmisión (MET) y Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Para el aislamiento se llevaron a cabo dos metodologías. La primera consistió en sembrar directamente en la línea celular continua DH82, células infectadas de nueve perros con signos clínicos de Ehrlichiosis Canina en cuyos FCB se observaron inclusiones basófilas intracitoplasmáticas en células mononucleares. La segunda metodología se realizó a través del establecimiento de cultivos primarios in vitro a partir de monocitos obtenidos de un perro infectado experimentalmente. El aislamiento del microorganismo se logró utilizando esta última metodología y esto se evidenció por la aparición de inclusiones basófilas y fluorescentes teñidas con la coloración de Giemsa e Inmunofluorescencia Directa respectivamente. Para comprobar la infectividad de los cultivos primarios se inoculó un segundo canino. Con muestras sanguíneas extraídas antes de la inoculación, este animal resultó seronegativo al antígeno de E. canis y al realizar la PCR con cebadores específicos para E. canis y E. chaffeensis no hubo amplificación de los productos esperados. Mediante la observación de las características ultraesructurales de los cuerpos elementales dentro de vacuolas intracitoplasmáticas de células mononucleares, se determinó que las inclusiones basófilas observadas en los FCB de los nueve perros, corresponden a bacterias del grupo Ehrlichia Monocítica Canina. Utilizando cebadores específicos para las Ehrlichias monocíticas E. canis y E. chaffeensis se estandarizó la técnica PCR anidada. Luego de aplicada esta técnica a las nueve muestras sanguíneas de perros se identificó la especie E. canis en todos los perros y E. chaffeensis en cuatro de estos animales. También se determinó la presencia de E. canis y E. chaffeensis en las muestras del primer perro inoculado experimentalmente, en los cultivos primarios y en las muestras del segundo canino infectado experimentalmente. Estos resultados constituyen el primer reporte en el país y sur América de infección con E. chaffeensis en caninos y de coinfección con dos especies monocíticas