Evaluación de la evolución de metabolitos de cacao (Theobroma cacao L.) durante el tiempo de fermentación, aplicando análisis instrumental de cromatografía líquida de ultra alta resolución acoplada a espectrometría de masas (CLUR-EM), con un abordaje no dirigido

Abstract

La fermentación es una etapa crítica en el procesamiento de cacao, principalmente por su impacto en la calidad. En esta etapa se desarrollan los precursores de aromas y sabores, mediante reacciones bioquímicas dentro de las semillas. A pesar de que se han identificado diversos compuestos, todavía se requiere mayor investigación en el tema. Es por esto que en esta investigación se empleó una estrategia de metabolómica, con un abordaje no dirigido, para identificar los metabolitos que presentaron los mayores cambios en tres etapas: a) de 0-2 días, b) de 3 a 4 días y c) de 5 a 6 días de fermentación. Se estudiaron tres tipos de cacao, los cuales se fermentaron bajo el sistema de cajón. El clon IMC-67 se fermentó en tres ensayos independientes, en una caja de poliestireno de 23 x 22 x 17 cm y con una carga promedio de 40 kg. Cacao de Trinidad y Tobago, con genética desconocida, se fermentó en un ensayo en un cajón de madera con una carga de 30 kg. Finalmente, cacao de Upala (Costa Rica), con genética desconocida, se fermentó en un cajón de madera de 1,0 x 1,0 x 0,5 m, con una carga cercana a 100 kg. Los muestreos se realizaron diariamente, y las muestras se congelaron hasta finalizar las fermentaciones. Posteriormente se secaron hasta un 7% de humedad. Las muestras se descascarillaron, molieron y desgrasaron. Finalmente, se extrajeron con una solución de acetona:agua:ácido acético (70:29,5:0,5%). Los extractos evaporados y filtrados, se diluyeron en agua y almacenaron en congelación hasta su medición. Estos extractos se separaron y midieron en un UPLC-ESI-Q-ToF-MS, con una columna C18, y con ionización tanto positiva como negativa. Los datos obtenidos se preprocesaron con el programa MZMine, obteniéndose 2979 iones. Estos iones se emplearon como variables para realizar modelos estadísticos multivariados; las cuales se normalizaron con el algoritmo de Pareto y se transformaron logarítmicamente. El análisis de componentes principales (PCA) evidenció que, en etapas avanzadas de la fermentación, las muestras tendían a agruparse, independientemente de su procedencia. Adicionalmente se vio una agrupación según los días de fermentación: 0-2 días, 3 a 4 días y 5 a 6 días; lo cual fue coherente con las etapas biológicas: inicios-fermentación anaerobia, fermentación aerobia, final de la fermentación, respectivamente. El análisis discriminante (PLS-DA) se realizó con estos tres grupos y fue validado. Se utilizó el criterio de índice VIP para reducir las variables de estudio a 56 iones. De estas, se identificaron tentativamente 20 iones, predominando tres naturalezas químicas: azúcares, aminoácidos/oligopéptidos y flavanoles. Algunos metabolitos que destacaron fueron la (epi) catequina, dímeros y trímeros de procianidinas, antocianinas y oligopéptidos de entre 3 y 12 aminoácidos. En general, los metabolitos propuestos como azúcares y flavanoles mostraron una tendencia a la reducción continua durante el tiempo de fermentación. Caso contrario se presentó en los oligopéptidos, los cuales presentaron un aumento continuo o un máximo en la etapa de fermentación intermedia (3-4 días). Esta investigación es una base para futuros estudios de caracterización de cacao, que permitirán optimizar procesos en la cadena de valor del cacao. Además, considerando la relevancia nutricional de los flavanoles, es posible plantear nuevas fermentaciones que contemplen criterios no sólo asociados al desarrollo de precursores de aromas y sabores (como aminoácidos y oligopéptidos), sino también a la retención de polifenoles.

Fermentation is a critical step in cocoa processing, because of its impact in quality. In This step flavor precursors are developed by means of biochemical reactions in the beans. Although several cocoa compounds have been reported, there is still a need of more research. This study applied a non targeted metabolomic approach to identify the metabolites that had the bigger changes in three stages: a) 0-2 days, b) 3-4 days and c) 5 to 6 days of fermentation. Three different coco types were subjected to box fermentation. Clon IMC-67 was fermented in three independent assays, in a polystyrene box (23x22x17 cm) with 40 kg of load. Cocoa variety (genetically undefined) from Trinidad and Tobago, was fermented in a wood box with 30 kg of load. Finally, genetically undefined cocoa from Upala, Costa Rica, was fermented in a wood box (1,0x1,0x0,5 m), with approximated 100 kg of load. Sampling was done daily, and the samples were frozen until the end of fermentation. Afterwards the cocoa was dried to 7% of moisture; husk was removed, and beans were grounded and defatted. Next they were extracted with acetone:water:acetic acid (70:29,5:0,5%). The extracts were filtered and evaporated, diluted with water, and frozen. These extracts were separated and measured in and UPLC-ESI-Q-ToF-MS, using a C18 column, and applying positive and negative modes. The data was preprocessed with MZmine software, and 2979 ions were obtained. These ions were employed as variables in statistical multivariate models; after their normalization via Pareto algorithm and logarithmic transformation. The principal component analysis (PCA), showed that in advanced fermentation stages, the samples clustered, independently of their origin. Additionally, samples were grouped in function of their fermentation day: 0-2 days, 3-4 days and 5-6 days; which was coherent with the biological steps: beginning-anaerobic fermentation, aerobic fermentation and fermentation ending, respectively. The discriminant analysis (PLS-DA) was constructed from these three groups, and was validated. VIP index was used for variable reduction, to obtain 56 ions. From these, 20 of them were tentatively identified, showing three predominating nature: sugars, aminoacids/oligopeptides and flavanols. Some of the main metabolites were (epi) catechin, dimers and timers of procyanidins, anthocyanins and oligopeptides with 3 to 12 aminoacids. In general, the metabolites annotated as sugars and flavanols, showed a tendency to a continuous reduction along fermentation time. A contrasting pattern was showed by oligopeptides which increased continuously or presented a maximum in 3-4 days of fermentation. This research is a base for future studies of cocoa characterization that could contribute to optimization of processes in favor of cocoa value chain. Besides, considering the nutritional importance of flavanols, it is possible to propose new fermentations that include criteria related not only to the development of flavor precursors (as aminoacids and oligopeptides), but also related to polyphenol retention.