Role of galectin-8 and dysfunctions by autoantibodies in the brain

Abstract

Galectin-8 belongs to a family of proteins that regulate a variety of cellular processes by interacting with beta-galactoside moieties present in glycoproteins. Galectin-8 has two carbohydrate recognition domains linked by a peptide chain and is unique among other galectins in the high preference for -2,3 sialic acids of its N-terminal carbohydrate recognition domain (N-CRD). In the brain, previous work in our laboratory has shown that Galectin-8 has immunosuppressor and neuroprotective functions. Galectin-8 is found in the cerebrospinal fluid in humans and one of the major regions of expression in the brain is the choroid plexus, the structure responsible for the generation of cerebrospinal fluid. Thus, this protein is expected to bathe most brain regions and may in principle contribute to generate a neuroprotective environment and perhaps modulate neuronal function. Our laboratory described autoantibodies against Galectin-8 in several inflammatory conditions, including patients with the autoimmune diseases Systemic Lupus Erythematosus and Multiple Sclerosis. Interestingly, a proteomic analysis of synaptosomes suggests that Galectin-8 might interact with α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors (AMPAR). This receptor is an ionotropic glutamatergic receptor that together with N-methyl-D-aspartate receptors (NMDAR) account for the principal excitatory ionotropic receptors in the brain. In the hippocampus, AMPAR and NMDAR are abundant and underlie synaptic plasticity involved in memory, emotions and other cognitive processes. Therefore, we propose the hypothesis that “Galectin-8 modulates glutamatergic functions that can be interfered with anti-Gal-8 antibodies”. Our results first corroborate by pull-down assays that Galectin-8 binds AMPAR and this interaction involves -2,3 sialic acids and the Galectin-8 N-CRD. Cell surface biotinylation and immunofluorescence assays in neuronal primary culture reveal that Galectin-8 increases the cell surface levels of AMPAR in just 1 hour treatment. The mechanism involves an enhanced recycling to the cell surface without affecting endocytosis, as shown by live-cell imaging of neurons transfected with ph-sensitive pHluorin-tagged GluA1 (GluA1-SEP) and by reducible biotin assays, respectively. This effect requires the activity of protein kinase A (PKA), known to increase AMPAR recycling to the cell surface, as well as focal adhesion kinase (FAK), a downstream effector of integrins. Neither AMPAR nor NMDAR inhibitors affect the Galectin-8-mediated increase of AMPAR cell surface levels, thus discarding a role of the activity of these receptors. Electrophysiology assays in the CA3-CA1 hippocampal circuit in ex vivo brain slices reveal that Galectin-8 has enhancing or inhibitory effects upon AMPAR glutamatergic transmission, at low or high concentrations, respectively. High Galectin-8 concentrations stimulate the inhibitory gamma-aminobutyric acid type A receptors (GABAAR) transmission. Experiments in primary neurons show that Galectin-8 also augments cell surface GABAAR involving sialic acid mediated interactions with surface glycans. The mechanism remains unknown. Next we tested the effect of Galectin-8 N-CRD and anti-Galectin-8 autoantibodies as tools to inhibit Galectin-8 functions. Interestingly, Galectin-8 N-CRD strongly reduced glutamatergic synaptic transmission and with anti-Galectin-8 antibodies from Multiple Sclerosis patients we find reduction of long-term potentiation. These results indicate a stimulating role of endogenous Galectin-8 upon glutamatergic transmission and suggest that anti-Galectin-8 antibodies might play pathogenic roles inhibiting Galectin-8-dependent cognitive processes. Supporting these possibilities, we find that Galectin-8 knockout mice have lower AMPAR levels in the postsynaptic, reduced synaptic plasticity and impaired spatial memory compared to wild type mice. In addition, this thesis includes studies dealing with autoantibodies against ribosomal P proteins (anti-P) from Systemic Lupus Erythematosus patients, which associate with psychosis and cognitive dysfunction in this autoimmune disease. Our laboratory described that anti-P antibodies cross-react with a protein of unknown function that exposes a P-Epitope at the neuronal cell surface and is somehow required in glutamatergic transmission. As a tool to study the pathogenic mechanisms of these antibodies we generated murine and human monoclonal antibodies against the known P-epitope conformed by a sequence of 11 residues (SDEDMGFGLFD) in a collaborative effort with Dr. Betty Diamond (Feinstein Institute for Medical Research, NY., USA). Anti-P antibodies were obtained from murine hybridomas and from cloned cDNA from single cell memory B cells from a Systemic Lupus Erythematosus patient. We show that these monoclonal antibodies bind to the P-Epitope on ELISA assays and perturb synaptic transmission, thus prompting further characterization. In summary, the main studies in this thesis revealed Galectin-8 as a new synaptic regulator of glutamatergic transmission, which can be potentially interfered by anti-Galectin-8 antibodies and contribute to cognitive dysfunctions.

Galectina-8 pertenece a una familia de proteínas que regulan una variedad de procesos celulares al interactuar con residuos β-galactósidos presentes en las glicoproteínas. Galectina-8 tiene dos dominios de reconocimiento de carbohidratos unidos por una cadena peptídica y es única entre otras galectinas por su alta preferencia por los ácidos siálicos en α-2,3 por su dominio de reconocimiento de carbohidratos N-terminal (N-CRD). En el cerebro, trabajos previos en nuestro laboratorio han demostrado que Galectina-8 tiene funciones inmunosupresoras y neuroprotectoras. Galectina-8 se encuentra en el líquido cefalorraquídeo de los seres humanos y una de sus principales regiones de expresión en el cerebro es el plexo coroideo, la estructura responsable de la generación de líquido cefalorraquídeo. Por tanto, se espera que esta proteína bañe la mayoría de las regiones del cerebro y, en principio, puede contribuir a generar un entorno neuroprotector y quizás modular la función neuronal. Nuestro laboratorio describió autoanticuerpos contra Galectina-8 en varias afecciones inflamatorias, incluyendo pacientes con enfermedades autoinmunes, como el lupus eritematoso sistémico y esclerosis múltiple. Curiosamente, un análisis proteómico de sinaptosomas sugiere que Galectina-8 podría interactuar con los receptores de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPAR). Este receptor es un receptor glutamatérgico ionotrópico que junto con los receptores de N-metil-D-aspartato (NMDAR) representan los principales receptores ionotrópicos excitatorios en el cerebro. En el hipocampo, AMPAR y NMDAR son abundantes y subyacen la plasticidad sináptica involucrada en la memoria, las emociones y otros procesos cognitivos. Por tanto, proponemos la hipótesis de que “Galectina-8 modula funciones glutamatérgicas que pueden ser interferidas con anticuerpos anti-Galectina-8”. Nuestros resultados primero corroboran mediante ensayos de pull-down que Galectina-8 se une a AMPAR y esta interacción involucra ácidos siálicos α-2,3 y el N-CRD de Galectina-8. Los ensayos de biotinilación e inmunofluorescencia de la superficie celular en cultivo primario neuronal revelan que Galectina-8 aumenta los niveles de AMPAR en la superficie celular en tan solo 1 hora de tratamiento. El mecanismo implica un mayor reciclaje a la superficie celular sin afectar la endocitosis, como lo muestran las imágenes de células vivas de neuronas transfectadas con GluA1 etiquetado con pH-fluorina sensible al pH (GluA1-SEP) y mediante ensayos de biotina reducible, respectivamente. Este efecto requiere la actividad de la proteína quinasa A (PKA), que se sabe que aumenta el reciclaje de AMPAR a la superficie celular, así como la quinasa de adhesión focal (FAK), un efector río abajo de las integrinas. Ni los inhibidores de AMPAR ni de NMDAR afectan el aumento de los niveles de superficie celular de AMPAR mediado por Galectina-8, descartando así un papel de la actividad de estos receptores. Los ensayos de electrofisiología en el circuito hipocampal CA3-CA1 en cortes de cerebro ex vivo revelan que Galectina-8 tiene efectos potenciadores o inhibidores sobre la transmisión glutamatérgica de AMPAR, a concentraciones bajas o altas, respectivamente. Las concentraciones elevadas de Galectina-8 estimulan la transmisión inhibitoria de los receptores de ácido gamma-aminobutírico tipo A (GABAAR). Los experimentos en neuronas primarias muestran que Galectina-8 también aumenta los GABAAR de la superficie celular implicando interacciones mediadas por ácido siálico con glicanos de superficie. El mecanismo sigue siendo desconocido. A continuación, probamos el efecto de el dominio N-CRD de Galectina-8 y los autoanticuerpos anti-Galectina-8 como herramientas para inhibir las funciones de Galectina-8. Curiosamente, el N-CRD de Galectina-8 redujo fuertemente la transmisión sináptica glutamatérgica y con los anticuerpos anti-Galectina-8 de pacientes con esclerosis múltiple encontramos una reducción de la potenciación a largo plazo. Estos resultados indican un papel estimulante de la Galectina-8 endógena sobre la transmisión glutamatérgica y sugieren que los anticuerpos anti-Galectina-8 podrían desempeñar funciones patogénicas inhibiendo los procesos cognitivos dependientes de Galectina-8. Apoyando estas posibilidades, encontramos que los ratones carentes de Galectina-8 tienen niveles más bajos de AMPAR en el postsináptico, plasticidad sináptica reducida y memoria espacial deteriorada en comparación con los ratones silvestres. Además, en esta tesis se incluyen estudios sobre autoanticuerpos contra las proteínas P ribosomales (anti-P) de pacientes con Lupus Eritematoso Sistémico, que se asocian con psicosis y disfunción cognitiva en esta enfermedad autoinmune. Nuestro laboratorio describió que los anticuerpos anti-P reaccionan de forma cruzada con una proteína de función desconocida que expone un epítopo-P en la superficie de la célula neuronal y de alguna manera se requiere en la transmisión glutamatérgica. Como herramienta para estudiar los mecanismos patogénicos de estos anticuerpos, generamos anticuerpos monoclonales de ratones y humanos contra el epítopo-P conocido conformado por una secuencia de 11 residuos (SDEDMGFGLFD) en un esfuerzo de colaboración con la Dra. Betty Diamond (Instituto Feinstein de Investigación Médica, Nueva York, EE. UU.). Los anticuerpos anti-P se obtuvieron de hibridomas murinos y de ADNc clonado individualmente de células B de memoria de un paciente con lupus eritematoso sistémico. Demostramos que estos anticuerpos monoclonales se unen al epítopo-P en ensayos ELISA y perturban la transmisión sináptica, lo que promueve a una mayor caracterización. En resumen, los principales estudios de esta tesis revelaron que Galectina-8 es un nuevo regulador sináptico de la transmisión glutamatérgica, que puede verse potencialmente interferido por anticuerpos anti-Galectina-8 contribuyendo a disfunciones cognitivas.