Evaluación de actividad transcripcional de un promotor identificado en el INTRÓN 5 del GEN RUNX1 como causa de susceptibilidad de esa región a daño en el ADN por tratamiento con etopósido.

Abstract

El gen RUNX1, reconocido como el regulador maestro de la hematopoyesis definitiva en humanos, participa en condiciones patológicas en diversas translocaciones cromosomales recíprocas asociadas a leucemia mieloide aguda. Una de las más frecuentes encontrada tanto en pacientes de leucemia mieloide aguda de novo, como secundaria, es la translocación cromosómica (8;21), en la que el gen RUNX1 se recombina con el gen ETO. En el gen RUNX1, los sitios de quiebre de la doble hebra del ADN que dan origen a esta translocación se encuentran en el intrón 5, confinados en tres regiones denominadas BCR1, BCR2 y BCR3. Se desconoce qué determina que estas regiones sean más susceptibles a sufrir quiebres en la doble hebra del DNA. No obstante, trabajo previo en nuestro laboratorio sugirió la posible existencia de un promotor putativo en la región BCR3. Teniendo esto en consideración, el objetivo de este estudio fue evaluar el estado de actividad transcripcional del promotor identificado en la región BCR3 del intrón 5 del gen RUNX1, y su correlación con daño por tratamiento con etopósido en distintas líneas celulares. Para ello, en primer lugar, se caracterizó el intrón 5 del gen RUNX1 usando datos de DNase-seq y ChIP-seq para la marca epigenética H3K4me3, encontrándose que las regiones BCR2 y BCR3 exhibían presencia de hipersensibilidad a DNasaI y asociación de H3K4me3 similar a lo encontrado regularmente en un promotor conocido. Luego, mediante análisis de lectura de secuencia para identificar elementos de promotor basal y posibles TSSs, en conjunto a datos de CAGE y de EST, obtenidos de ENCODE, se determinó que el promotor putativo de la región BCR3 da origen a un nuevo RNA largo no codificante, el que fue detectado en la línea celular mieloide KG-1 mediante RTPCR. Una vez confirmado que el promotor de la región BCR3 era activo, se realizó tratamiento con etopósido, droga que induce la generación de quiebres en la doble hebra del DNA, observándose mediante qPCR que en células KG-1 el tratamiento con etopósido producía daño en el DNA en la región BCR3. Por el contrario, en la línea celular Colo320, en la que no se transcribe el nuevo RNA largo no codificante, no se observó daño en la región BCR3 asociado al tratamiento con etopósido. Finalmente, al inhibir la transcripción en células KG1 haciendo un pre-tratamiento con flavopiridol, se previno el daño producido en la región BCR3 por tratamiento con etopósido. En conjunto, los resultados obtenidos muestran que el promotor identificado en la región BCR3 del intrón 5 del gen RUNX1 es activo, y que la actividad transcripcional del mismo se correlaciona con la susceptibilidad de la región BCR3 a sufrir quiebres en la doble hebra del ADN inducidos por tratamiento con etopósido.