Participación del ácido lisofosfatídico en la angiogénesis del trofoblasto humano de primer trimestre

Abstract

El establecimiento de la preñez depende de una adecuada coordinación entre diferentes procesos vasculares que ocurren en la interfase materno-fetal. En las etapas tempranas, el trofoblasto extravelloso invasor cumple un rol crítico ya que reemplaza a las células endoteliales de los vasos remodelando las arterias espiraladas uterinas. Durante este proceso, el trofoblasto adquiere un fenotipo endotelial y tapiza las arterias espiraladas del útero transformando los vasos musculares rígidos en sacos sinusoidales flácidos. Este remodelado es fundamental ya que de él depende la formación de la placenta y la llegada de oxígeno y nutrientes al embrión en crecimiento. Se ha postulado que defectos en este mecanismo podrían contribuir a la disfunción placentaria provocando complicaciones obstétricas como las fallas implantatorias o la preclampsia. En nuestro laboratorio estudiamos el rol de mediadores lipídicos en los procesos que tienen lugar en la interfase materno-fetal. En particular, teniendo en cuenta resultados propios y de otros grupos de investigación, en este proyecto nos propusimos investigar el rol del ácido lisofosfatídico (LPA), un potente mensajero de origen lipídico que ejerce su función a través de 6 receptores (LPA1-6). El estudio de la participación del LPA en la implantación del blastocisto, ha puesto de manifiesto el rol preponderante del receptor LPA3 en las primeras etapas de la gestación4-6. Sin embargo, el papel del LPA en la adquisición del fenotipo endovascular del trofoblasto humano de primer trimestre, así como en la transformación de la vasculatura uterina durante las etapas tempranas de la gestación, aún no han sido estudiados. Por lo tanto, el objetivo general del presente trabajo es investigar el rol del LPA en la angiogénesis de la interfase maternofetal durante la gestación temprana. Dada la imposibilidad ética de estudiar el proceso de implantación en humanos, necesariamente se debe recurrir a modelos experimentales in vitro (cultivos de líneas celulares) e in vivo (animales de laboratorio). Por lo tanto, en el presente trabajo adoptamos dos estrategias experimentales. En el primer diseño, utilizamos una línea celular de trofoblasto humano de primer trimestre, HTR-8/SVneo (H8), para investigar la acción in vitro del LPA en la respuesta endovascular del trofoblasto. En el segundo, hembras de la cepa Wistar en día 5 de gestación recibieron una dosis única intra-uterina de un antagonista selectivo del LPA3 (DGPP 0.1 mg/kg). Mediante este diseño experimental in vivo investigamos la participación del LPA endógeno y su receptor LPA3 en diferentes aspectos de la fisiología vascular uterina durante la implantación embrionaria. Observamos que la el LPA induce la formación de túbulos, la migración y la proliferación del trofoblasto humano de primer trimestre, indicando que este mediador lipídico promueve la angiogénesis in vitro del trofoblasto en la interfase materno-fetal. Utilizando antagonistas selectivos de los diferentes subtipos de receptores de LPA, observamos que la formación de túbulos está mediada por el LPA3. Este nuevo rol del LPA en las funciones del trofoblasto implica la participación de las vías de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) y de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), siendo el óxido nítrico el último efector en esta cascada de señalización. Además, estudiamos la expresión de diferentes mediadores angiogénicos (VEGF-C, IL-8, IL-6) y observamos que el LPA incrementa la expresión del mRNA de IL-6, y que la liberación de esta citoquina al sobrenadante de cultivo media el efecto del LPA sobre la angiogénesis del trofoblasto. Las hormonas esteroideas, estradiol y progesterona, funcionan como grandes orquestadoras de los procesos que tienen lugar en el sitio de implantación durante las primeras etapas de la gestación. Observamos que la incubación con estradiol y progesterona promueve el fenotipo endovascular del trofoblasto y que este efecto está mediado por el receptor LPA3. La interacción del trofoblasto con el endotelio es fundamental durante el remodelado de las arterias espiraladas. Por lo tanto, decidimos investigar si la adquisición del fenotipo endovascular del trofoblasto inducido por LPA, modula el comportamiento de las células endoteliales. Para ello, utilizamos medios condicionados provenientes de ensayos de tubulogénesis de las células H8 incubadas con LPA. Observamos que estos sobrenadantes promueven la migración de las células endoteliales (línea EA.hy926). Esta interacción trofoblasto-endotelio ocurre por la secreción de factores solubles que involucran los productos de las vías de la COX-2, la iNOS y la IL-6. Por último, observamos que el bloqueo farmacológico in vivo del receptor LPA3 aumenta la reabsorción embrionaria en ratas (~60%), lo que se correlaciona con defectos en la macro y microvasculatura, apoyando por lo tanto los resultados obtenidos in vitro. En resumen, en este trabajo de tesis hemos demostrado que el LPA promueve los procesos vasculares del sitio de implantación regulando el fenotipo endovascular del trofoblasto, la interacción trofoblastoendotelio, y el desarrollo de los vasos sanguíneos del útero. Además, describimos que estos fenómenos estarían modulados por las hormonas esteroideas, las cuales son partícipes fundamentales de los eventos que tienen lugar durante la implantación embrionaria. Estos resultados nos permiten postular nuevas funciones para el LPA vinculadas con el remodelado vascular que tiene lugar en la interfase materno-fetal durante la gestación temprana, mecanismo fundamental para el mantenimiento y el progreso del embarazo.

The establishment of successful pregnancy requires a profound reorganization of uterine and fetal tissues. The coordination of vascular processes at the maternal-fetal interface is crucial and involves extravillous trophoblast differentiation into endovascular trophoblast. Endovascular trophoblast invades maternal spiral arteries, and not only disrupts the endothelium-myometrium interactions, but also replaces endothelial and myometrial cells, while acquiring an endothelial-like phenotype. The adequate remodeling of the uterine vessels ensures sufficient blood flow in response to the increasing metabolic demands of the embryo. Failure to achieve these transformations is correlated with severe obstetric complications such as implantation failure and preeclampsia. Much effort is being made to elucidate the molecules and mechanisms that underlie the transformation of fetal trophoblast into the endovascular phenotype. Understanding the possible causes of the disorders associated with inadequate vascular remodeling would help to design new strategies to alleviate these pathologies. Some of the most widely studied mediators in reproduction are the phosphorylated lipids such as Lysophosphatidic acid (LPA). LPA regulates several female reproductive functions through 6 G-protein coupled receptors, LPA1-6. LPA participates in embryo implantation and contributes to vascular physiology in different biological systems. However, the role of LPA on vascular processes at the implantation site has not been investigated. We adopted an in vitro and an in vivo pharmacological approach to study LPA action on trophoblast endovascular response and uterine transformation during early gestation. The HTR-8/SVneo cell line (H8) was used to model the acquisition of the trophoblast endovascular phenotype in vitro. We observed that LPA increased trophoblast tube formation, migration and proliferation. By using selective antagonists, we showed that enhanced tubulogenesis was mediated by LPA3 receptor. In addition, COX-2 and iNOS pathways participated in LPA-stimulated tubulogenesis, being nitric oxide the last effector. When we investigated if the master hormones that orchestrate crucial events at the implantation sites, modulate trophoblast angiogenesis, we observed that estradiol + progesterone increased H8 tube formation via LPA3. The interaction between the trophoblast and the endothelium is relevant during the remodeling of the spiral arteries. We demonstrated that trophoblast LPA-triggered secreted factors increased the migration of the EA.hy926 endothelial cell line. Finally, the administration of a selective LPA3 antagonist to Wistar rats in day 5 of gestation increased the rate of embryo resorption (60%) associated to macro and microvascular defects. Our results demonstrate a new role for LPA during spiral artery remodeling at the maternal-fetal interface, and could help to elucidate the causes of obstetric complications as implantation failure and preeclampsia.