Desarrollo de estrategias de ingeniería de tejidos para la regeneración ósteo-cartilaginosa

Abstract

La ingeniería de tejidos es una ciencia multidisciplinaria que involucra el diseño y desarrollo de biomateriales que puedan funcionar como sustitutos biológicos para la reparación o sustitución de tejidos u órganos dañados. Este enfoque evita el gran inconveniente de las técnicas de implantes como la escasez de donantes de tejidos y órganos, el rechazo inmunológico, entre otros. La evidencia acumulada hasta este momento ha demostrado que la estrategia basada en el uso de matrices tridimensionales (scaffolds) para ingeniería de tejidos tiene potencial para ser utilizada en la regeneración de una serie de tejidos y órganos y, en particular, es una alternativa prometedora para la reparación de lesiones osteocondrales, ya que podría utilizarse para regenerar tanto el hueso subcondral y el cartílago articular así como la interfaz hueso-cartílago.La hipótesis de este trabajo es que la combinación de materiales naturales y sintéticos permite lograr materiales con propiedades fisicoquímicas y biológicas adecuadas para la regeneración ósteo-cartilaginosa. Para probar nuestra hipótesis, diseñamos y desarrollamos un biomaterial, basado en un polímero sintético derivado de un polifumarato compatibilizado con un polímero natural (quitosano), el cual se estudió in vitro con distintos linajes celulares e in vivo en animales de experimentación, con el fin de evaluar su potencial aplicación como scaffold para la reparación de lesiones osteocondrales. Esta mezcla compatibilizada de polímeros permite combinar las ventajas de cada tipo de material. En particular, el quitosano presenta muy buena biocompatibilidad y baja citotoxicidad pero sus propiedades mecánicas y tasa de degradación no son las adecuadas para su aplicación en ingeniería tejidos óseo o cartilaginoso; mientras que los polímeros derivados de polifumarato han demostrado presentar mejores propiedades mecánicas y tasa de degradación regulable por la selección adecuada de la composición de comonómeros, pero poseen menor biocompatibilidad, motivo por el cual necesitan combinarse con otros materiales en vista a su aplicación. Como primer objetivo se propuso sintetizar un copolímero fumárico por copolimerización radical empleando energía de microondas a partir de acetato de vinilo y fumarato de diisopropilo, el mismo fue caracterizado utilizando diversas técnicas como: cromatografía de exclusión molecular (SEC), espectroscopia infrarroja con transformadas de Fourier (FTIR), resonancia magnética nuclear de protones (1H-RMN), calorimetría diferencial de barrido (DSC) y análisis termogravimétrico (TGA). Este copolímero se compatibilizó con quitosano por entrecruzamiento con adición de bórax. El biomaterial obtenido (PFVH-CHI-B) fue estudiado por espectroscopia infrarroja con transformadas de Fourier y sistema de reflectancia total atenuada (ATR-FTIR), microscopia electrónica de barrido (SEM), DSC y TGA. Además, se realizaron pruebas mecánicas, de hinchamiento y de degradación; encontrándose propiedades mecánicas del orden de las propias del hueso trabecular, un comportamiento de hinchamiento comparable con un hidrogel (como lo es el cartílago) y una buena tasa de degradación. Además, el material mostró una buena capacidad de estructuración logrando obtener scaffolds tanto por solvent casting o liofilización como por nanoestructuración mediante la infiltración en plantilla de óxido de aluminio anodizado (AAO) de distintas dimensiones. En particular, los scaffolds nanoestructurados presentaron una morfología de nanofibras homogénea como se demostró mediante SEM y espectroscopía Raman.A continuación, se realizaron estudios in vitro que mostraron que tanto el material obtenido por solvent casting (SC) como el nanoestructurado (SN) presentaban una muy buena biocompatibilidad, permitiendo la adhesión, proliferación y la diferenciación osteogénica de células progenitoras de médula ósea (CPMO), como así también el crecimiento de condrocitos primarios y la deposición de la matriz extracelular cartilaginosa. Estos resultados fueron demostrados mediante ensayos bioquímicos y la expresión de diferentes marcadores de fenotipo específicos evaluados por la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). Estos estudios in vitro mostraron además, que el cambio en la topografía de la superficie del scaffolds tiene influencia sobre el crecimiento y la diferenciación celular. Por otro lado, se evaluó la capacidad de producir respuesta inflamatoria, como medida de citotoxicidad, empleando un modelo de macrófagos en cultivo, encontrando que ni el material ni su nanoestructuración presentaban evidencias de efectos citotóxicos. Por último, para evaluar este biomaterial como sustituto óseo se empleó un modelo in vivo de lesión en calotas de ratas. Para ello, se realizó un defecto de craneotomía en cada hueso parietal, en el cual se implantó el biomaterial estructurado por liofilización. Luego de 30 días post-cirugía, se realizó una evaluación histológica donde se encontró una buena regeneración del tejido e integración de las células con el scaffold sin signos que evidencien el rechazo de dicho material. En conjunto, nuestros resultados indican que el biomaterial desarrollado combina adecuadamente las propiedades de los polímeros individuales, desde el punto de vista tanto fisicoquímico como de biocompatibilidad, mostrando su potencialidad en la regeneración ósteo-cartilaginosa.