Identificación de los genes del plásmido pUM505 implicados en la resistencia a quinolonas

Abstract

The pUM505 plasmid was isolated from a clinical strain of Pseudomonas aeruginosa; it has a length of 123 kilobases and contains 138 coding regions. DNA sequence analysis revealed that pUM505 lacks antibiotic resistance genes reported to date; however, when the plasmid was transferred to the P. aeruginosa PAO1 standard strain, conferred resistance to ciprofloxacin (Cp), an antibiotic of the quinolone family, which is used in the treatment of infections caused by Pseudomonas. In an attempt to identify the determinants responsible for resistance to Cp, a group of genes from pUM505 was selected (orf35, orf36 and orf37) because it probably encodes a tripartite efflux system. It was found that these genes confers Cp resistance only when they were transferred to the Escherichia coli J53-2 strain, suggesting that Cp resistance in P. aeruginosa is caused by additional pUM505 genes. The aim of this study is identify genes of pUM505 involved in Cp resistance. Initially, the plasmid was transferred to the P. aeruginosa PAO1SR strain for the setting-up of a mutant bank by random transposition. Mutants were selected by ciprofloxacin sensitive (CpS), gentamycin and streptomycin resistance. From a total of 12,000 clones tested, 12 CpS mutants were obtained, and using susceptibility tests to Cp. The mutants were divided into sensitive and hypersensitive. By DNA sequencing, it was determined that in sensitive mutants a probable operon form by orf57, orf58 and orf59 was disrupted, while in hypersensitive mutants was disrupted a probable operon form by orf85, orf86 and orf87.

El plásmido pUM505 fue aislado de una cepa clínica de Pseudomonas aeruginosa, posee un tamaño de 123 kilobases y cuenta con 138 marcos de lectura abiertos (ORF). Un análisis in silico reveló que el plásmido no posee genes de resistencia a antibióticos reportados hasta la fecha; sin embargo, al ser transferido a la cepa de P. aeruginosa PAO1 se encontró que pUM505 confiere resistencia a ciprofloxacina (Cp), un antibiótico de la familia de las quinolonas empleado en el tratamiento de infecciones causadas por esta bacteria. Para tratar de identificar los determinantes responsables de la resistencia a Cp, se seleccionó un grupo de genes (orf35, orf36 y orf37) de pUM505 que probablemente codifican un sistema de expulsión tripartita. Se encontró que estos genes confieren resistencia a Cp únicamente cuando se transfieren a la cepa de Escherichia coli J53-2, lo cual sugiere que se trata de genes adicionales los responsables de la resistencia en P. aeruginosa. El objetivo del presente trabajo es identificar genes de pUM505 implicados en la resistencia a Cp. Inicialmente el plásmido fue transferido a la cepa de P. aeruginosa PAO1SR para la generación de un banco de mutantes por transposición al azar. Se seleccionaron mutantes sensibles a ciprofloxacina (CpS) y resistentes a gentamicina y estreptomicina. De un total de 12,000 mutantes probadas, se obtuvieron 12 mutantes CpS y empleando pruebas de susceptibilidad a Cp se dividieron en sensibles e hipersensibles. Mediante secuenciación se determinó que en las mutantes sensibles se encuentra interrumpido un probable operón formado por los orf57, orf58 y orf59, mientras que en las mutantes hipersensibles está interrumpido un probable operón formado por los orf85, orf86 y orf87.