Introducción. Las manifestaciones clínicas causadas por los arbovirus Chikungunya (CHIKV), Dengue (DENV) y Zika (ZIKV) son similares, por esta razón, se requiere un diagnostico diferencial para la identificación del agente etiológico en caso de infección. Adicionalmente, la determinación de la carga viral es importante para la evaluación de la dinámica de la replicación viral en el huésped en entornos clínicos y experimentales, así como para la evaluación de posibles tratamientos antivirales. Este estudio tuvo como objetivo diseñar y evaluar un ensayo RT-qPCR para la cuantificación y detección simultanea de los virus Chikungunya, Dengue y Zika aislados de cultivos celulares, como paso previo a su detección simultánea en muestras clínicas. Metodología. Se diseñó el constructo Mpx_CHIKV-DENV-ZIKV(T7-SP6) para la generación in vitro de un fragmento quimérico de ARN que contenía los sitios de unión de los primers y sondas para la amplificación de fragmentos genómicos seleccionados de los tres virus por reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) en un sistema “multiplex”. Se realizaron ensayos de amplificación para verificar la integridad del constructo, la posterior eliminación del ADN molde y la estandarización de las condiciones de reacción. El límite de detección (LoD) del sistema de amplificación fue determinado en reacciones “single” y “multiplex” para cada virus con el fin de determinar el desempeño en la detección y la cuantificación absoluta de carga viral. Adicionalmente el sistema de amplificación fue evaluado en aislados clínicos provenientes de sobrenadantes de cultivos celulares y extracciones de ARN de tejido de ratón infectado. Resultados. A partir de 115 ng de ADN del constructo Mpx_CHIKV-DENVZIKV(T7-SP6) se obtuvo 11.290 ng de ARN, posterior al tratamiento con RQ1-DNAse. El LoD en singleplex fue 6.37 x 103 , 1.56 x 103 y 4.68 x 101 copias de genoma equivalente por reacción (GCE/Rxn) para CHIKV, DENV 1-4 y ZIKV respectivamente. El LoD en sistema multiplex fue 5.42 x 104 GCE/Rxn para CHIKV y ZIKV y 1.60 x 105 GCE/Rxn para DENV 1-4. Ambos, sistemas single y multiplex, permitieron la detección y la cuantificación de muestras provenientes de sobrenadante de cultivo celular y muestras de tejido de ratón infectados. Conclusiones. La prueba Mpx-CHK_DEN_ZK diseñada en este estudio, permitió la detección y cuantificación simultánea de CHIKV, DENV y ZIKV; obteniendo mayor sensibilidad en el formato singleplex. Posterior a su validación utilizando muestras clínicas de pacientes infectados y coinfectados, este ensayo podría ser utilizado para la detección de los mencionados virus en contextos de diagnóstico, vigilancia epidemiológica e investigación