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CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA Y ESTRUCTURAL DE UNA LIPASA DE Vibrio parahaemolyticus CAUSANTE DE SINDROME DE MORTALIDAD TEMPRANA EN CAMARÓN BLANCO
Autor
CRISTOBAL JOEL GONZALEZ PEREZ
Institución
Resumen
En 2013 en México, se presentó una grave disminución en la producción de
camarón blanco Litopenaeus vannamei, la cual fue asociada a la presencia de
cepas patógenas de la bacteria Vibrio parahaemolyticus. Estas mortalidades se
asocian al síndrome de mortalidad atípica (early mortality syndrome o EMS,
acute hepatopancreatic necrosis disease o AHPND). En un trabajo previo se
estudió el genoma de dos cepas de Vibrio, una patógena y una inocua para el
camarón. En dichos genomas se identificaron enzimas lipasas, de las cuales se
seleccionó una para su estudio y caracterización, designada LipVp (Lipasa de
Vibrio parahaemolyticus). Las lipasas confieren a las bacterias la capacidad de
utilizar lípidos como única fuente de carbono e incluso pueden tomar parte en la
virulencia de éstas. Después de seleccionar a LipVp se alineó contra otras
lipasas y se modeló con el algoritmo PHYRE2, encontrándose mayor similitud
con una lipasa de Pseudomonas aeruginosa. En el modelo teórico de LipVp se
localizó la tríada catalítica conformada por S86, D233 e H255, 5 laminas-β
interconectadas con 10 hélices-α, el agujero oxianiónico y posibles aminoácidos
para formar un sitio de unión a calcio. Se diseñó un gen sintético con la
secuencia de LipVp el cual fue utilizado para transformar bacterias E. coli BL21
(DE3). La LipVp recombinante se obtuvo en cuerpos de inclusión, los cuales
fueron solubilizados con urea 8 M, posteriormente se dializó contra urea 4 M,
para proceder a purificar la proteína por cromatografía de afinidad a metales
(IMAC). El replegamiento de LipVp se realizó mediante diálisis con buffer
conteniendo: Tris-HCl 55 mM pH 8.0, NaCl 10.56 mM, KCl 0.44 mM,
polietilenglicol 3350 0.055%, MgCl2 2.2 mM, CaCl2 2.2 mM, L-arginina 550 mM,
glutatión reducido 0.5 mM y glutatión oxidado 0.05 mM. Se determinó una Km=
4.34 mM y una Vmax= 0.018 μM/min utilizando p-nitrofenil laurato como sustrato.
Por último, se comprobó la inhibición de la actividad enzimática con Orlistat®
(tetrahidro lipstatin: (S)-((S)-1-((2S,3S)-3-hexil-4-oxooxetan-2-il) tridecan-2-il) 2-
formamido-4-metil pentanoato). En conclusión se corroboró que LipVp codifica
para una lipasa funcional, donde se predice una estructura similar a otras.
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