Tese de doutorado
Perfil proteômico de podócitos editados geneticamente pela tecnologia CRISPR/Cas9 expressando características fenotípicas da doença de Fabry
Fecha
2022-09-01Autor
Monte Neto, Jose Tiburcio [UNIFESP]
Institución
Resumen
Introdução: Lesão dos podócitos e subsequente nefropatia crônica progressiva são características proeminentes da Doença de Fabry (DF), desordem de depósito lisossômico com padrão de herança ligada ao X provocada por mutações do gene GLA levando à atividade insuficiente da enzima α-GAL (α-galactosidase A). Embora as consequências clínicas tardias da nefropatia da DF sejam bem conhecidas, os eventos moleculares que deflagram a lesão podocitária carecem de estudos. O objetivo do presente estudo foi investigar a expressão diferencial de proteínas em podócitos humanos imortalizados com características fenotípicas da DF obtidas pela edição prévia do gene GLA através da tecnologia CRISPR/Cas9. Métodos: Os podócitos foram avaliados comparativamente: (i) quanto ao padrão proteico e processos biológicos alterados, através da abordagem proteômica e gene ontology (GO), (ii) quanto às vias de sinalização afetadas, por protocolo de western blot (WB) e RT-PCR e (iii) quanto à indução de apoptose, por meio de microscopia de fluorescência utilizando o marcador iodeto de propídio (IP). Resultados: A proteômica exploratória mostrou que as proteínas UCHL1 (<1,42x), HSP60 (<1,43x) e α-enolase1 (<1,61x) apresentavam significativa menor abundância nos podócitos geneticamente modificados em relação aos controles. A avaliação funcional por GO revelou que as proteínas alteradas encontram-se envolvidas nos processos biológicos seguintes: regulação da autofagia, apoptose e resposta ao VEGF. A análise comparativa por WB mostrou que os podócitos editados apresentavam significativa maior expressão das seguintes proteínas: (1) LC3B (>1,4x) e p62 (>1,7x), biomarcadores da autofagia, revelando inibição do fluxo autofágico. (2) TGF- (>1,5x), VEGF (>1,5x) e Vimentina (>2,3x), marcadores das vias pró-fibróticas, resposta vascular e transição epitélio mesenquimal, respectivamente; (3) PI3K 110 (>2,5x) e PI3K 110 (>1,45x), vias associadas com hipertrofia e apoptose. Paralelamente, os podócitos editados, em relação ao grupo controle, apresentaram significativa menor expressão de mRNA das proteínas estruturais podocalixina (<0,5x) e CD2AP (<0,4x) e, também, maior densidade de células apoptóticas. Conclusões: O presente estudo demonstrou que a deficiência de atividade da α-GAL, após a deleção do gene GLA por edição gênica CRIPR/Cas9, induz efeitos adversos sobre os podócitos, incluindo: (1) menor abundância das proteínas: UCHL1, HSP60 e α-enolase; (2) ativação de vias de sinalização adquirindo um padrão proliferativo, pró-fibrótico, de hiperreatividade vascular e desdiferenciação celular; (3) defeitos das vias proteolíticas pela inibição simultânea do sistema ubiquitina-proteassoma e da via autofágica e (4) maior apoptose. Essas alterações representam efeitos deletérios sobre a funcionalidade e viabilidade dos podócitos, podendo estar potencialmente implicadas na patogênese da nefropatia da DF. Background: Podocyte damage and subsequent chronic progressive nephropathy
are prominent features of Fabry disease, a lysosomal storage disorder with an X-linked
pattern of inheritance caused by mutations in the GLA gene, leading to insufficient
α-GAL enzyme activity. Although the late clinical manifestations of FD nephropathy are
well known, the molecular events responsible for the pathogenesis need to be studied.
The aim of the present work was to investigate the differential expression of proteins
in immortalized human podocytes with FD phenotypic characteristics obtained with
previous editing of the GLA gene using CRISPR/Cas9 technology. Methods: The
podocytes were comparatively evaluated: (i) regarding the protein pattern and altered
biological processes, through the proteomic approach and gene ontology (GO), (ii)
regarding the affected signaling pathways, by western blotting protocol (WB) and (iii) )
regarding the induction of apoptosis, by means of fluorescence microscopy using the
propidium iodide (IP) marker. Results: Proteomics results showed: UCHL1 (<1.42x),
HSP60 (<1.43x) and α-enolase1 (<1.61x) proteins were significantly less abundant in
genetically modified podocytes than in controls. GO functional analysis revealed that
the changed proteins were involved in biological processes such as autophagy control,
apoptosis and VEGF response. Comparative analysis by WB showed that edited
podocytes showed significantly higher expression of the following proteins: (1) LC3
(>1.4x) and p62 (>1.7x), biomarkers of autophagy, revealing inhibition of autophagic
flux. (2) TGF-β (>1.5x), VEGF (>1.5x) and Vimentin (>2.3x), markers of profibrotic
pathways, vascular response and mesenchymal epithelial transition, respectively; (3)
PI3K 110 (>2.5x) and PI3K 110 (>1.45x) associated with hypertrophy and
apoptosis. In parallel, significantly lower mRNA expression of the structural proteins
podocalyxin (<0.5x) and CD2AP (<0.4x) were detected by RT-PCR in the edited
podocytes compared to the control group, in addition to a higher density of apoptotic
cells. Conclusions: Our study demonstrated that α-GAL deficiency due to GLA gene
editing induced changes to podocyte homeostasis including: (1) lower abundance of
the proteins UCHL1, HSPD1 and α-enolase1, which are involved in important
biological processes; (2) activation of signaling pathways involved in a proliferative,
profibrotic and vascular hyperreactivity pattern; (3) simultaneous dysregulation of the
ubiquitin-proteasome system and autophagic pathway, affecting proteolysis processes
and (4) increased apoptosis. These alterations, although may represent adaptive
responses of the podocyte to injury, could potentially be implicated in the pathogenesis
of Fabry disease nephropathy.