As doenças cardiovasculares são as principais causas de morte no mundo e podem ser causadas pela formação desordenada de fibrina nos vasos sanguíneos. Enzimas fibrinolíticas podem ser usadas para reestabelecer o fluxo sanguíneo normal. O objetivo deste trabalho foi produzir, purificar e caracterizar uma enzima fibrinolítica obtida a partir da microalga Chlorella vulgaris cultivada mixotroficamente usando milhocina, um subproduto agroindustrial do processamento do milho. O cultivo da microalga C. vulgaris utilizando 1% de milhocina obteve um Xm = 1637,45 mg L⁻¹, Pₓ = 181,93 mg L⁻¹ dia⁻¹ e atividade fibrinolítica (FU = 273,82 U mg⁻¹), bem como um menor valor de atividade proteásica total (PA = 33,22 U mg⁻¹). Ambas as enzimas foram purificadas por cromatografia de troca iônica. A enzima purificada de C. vulgaris apresentou uma atividade fibrinolítica de 1834,6 U mg⁻¹ (226,86 mm²) e peso molecular de 45 kDa, confirmado por SDS-PAGE e zimografia de fibrina. A enzima foi Fe⁺²-dependente e inibida pelo inibidor de metaloproteinase, EDTA (43,37%) e serino protease, PMSF (49,59%), caracterizando uma metal-dependente serino protease. Também apresentou taxa de hemólise menor que 4% e atividade trombolítica de 25,6% em apenas 90 minutos de reação. Assim, sugere-se que o cultivo mixotrófico de C. vulgaris utilizando milhocina é uma fonte promissora para produção de enzima fibrinolítica, diminuindo os custos industriais, agregando valor ao produto final e mostrando ser de interesse para as indústrias biomédica e farmacêutica.FACEPECardiovascular diseases are the leading causes of death in the world and may be caused by the disordered formation of fibrin in blood vessels. Fibrinolytic enzymes can be used to reestablish normal blood flow. The objective of this work was to produce, purify and characterize an fibrinolytic enzyme obtained from microalgae Chlorella vulgaris cultivated mixotrofically using corn steep liquor, an agroindustrial by-product of maize processing. The cultivation of C. vulgaris microalgae using 1% corncine obtained aXm = 1637,45 mg L⁻¹, Pₓ = 181,93 mg L⁻¹ day⁻¹ and fibrinolytic activity (FU = 273.82 U mg⁻¹) as well as a lower value of total proteasic activity (PA = 33.22 U mg⁻¹). Both enzymes were purified by ion exchange chromatography. The enzyme purified from C. vulgaris showed fibrinolytic activity of 1834.6 U mg⁻¹ (226.86 mm²) and molecular weight of 45 kDa, confirmed by SDS-PAGE and fibrin zymography. The enzyme was Fe⁺²-dependent and inhibited by the metalloproteinase inhibitor, EDTA (43.37%) and serine protease, PMSF (49.59%), characterizing a metal-dependent serine protease. It also presented hemolysis rate of less than 4% and thrombolytic activity of 25.6% in only 90 minutes of reaction. Thus, it is suggested that the mixotrophic culture of C. vulgaris using corn steep liquor is a promising source for the production of fibrinolytic enzyme, reducing industrial costs, adding value to the final product and showing that it is of interest to the biomedical and pharmaceutical industries.