La amplificación por reacción de la polimersa en cadena (RPC) de un fragmento del gen hsp65, seguido del análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (PLFR) por las enzimas BstEll y Haelll, ha demostrado ser muy útil en la identificación de micobacterias no tuberculosas (MNT). En el presente trabajo se les realizó una batería de pruebas bioquímicas así como la RPC-PLFR a un total de 13 cepas de referencia y 46 cepas recibidas en el laboratorio. Los resultados de las pruebas bioquímicas estuvieron disponibles entre 4 a 6 semanas, a diferencia de la RPC-PLFR que requirieron de sólo 48 horas. En ambos métodos, las especies detectadas con mayor frecuencia fueron Mycobacetrium intracellulare, M. kansasii y M. fortuitum. La RPC-PLFR es un método rápido, sencillo y eficaz. Su aplicación en los Laboratorios de Referencia pudiera ser de gran utilidad para el diagnóstico de MNT