Tesis
O soro apresenta maior proporção da variante Janus quinase 2 V617F comparado com amostras pareadas de sangue total-edta : um modelo de quantificação para variantes somáticas utilizando qPCR e o método de quantificação relativa 2- ∆∆cq
Fecha
2020-07-07Registro en:
ALMEIDA, Ana Luisa Santa Cruz de. O soro apresenta maior proporção da variante Janus quinase 2 V617F comparado com amostras pareadas de sangue total-edta: um modelo de quantificação para variantes somáticas utilizando qPCR e o método de quantificação relativa 2- ∆∆cq. 2020. 66 f., il. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde)—Universidade de Brasília, Brasília, 2020.
Autor
Almeida, Ana Luisa Santa Cruz de
Institución
Resumen
A detecção da variante JAK2 V617F faz parte dos
critérios diagnósticos para as neoplasias mieloproliferativas crônicas e proporções elevadas de
alelo mutante estão associadas a piores prognósticos. A mutação é geralmente detectada em
DNA de amostras de sangue total-EDTA através do método de PCR em tempo real alelo
específico (AS-qPCR) e quantificação absoluta. Entretanto, alguns equipamentos de extrações
de DNA automatizados co-extraem inibidores de PCR quando partem de sangue total e a
quantificação absoluta necessita de um esforço maior para gerar e manter as curvas padrão. A
variante JAK2 V617F pode ser detectada em soro através de PCR digital (ddPCR), uma
espécime que apresenta menos inibidores quando comparada ao sangue total e é mais amigável
aos extratores de DNA automatizados. Entretanto, equipamentos de ddPCR não são
amplamente disponíveis como os termocicladores de qPCR. Neste estudo, foi avaliado se a
variante patogênica JAK2 V617F pode ser corretamente quantificada por AS-qPCR através do
método de quantificação relativa 2-∆∆Cq em DNA de amostras de sangue total-EDTA e validar o
teste utilizando protocolos padrão em diagnóstico molecular. Em seguida, o método proposto foi
aplicado para avaliar se a mutação pode ser corretamente detectada/quantificada em DNA de
amostras de soro. O método proposto mostrou-se altamente exato (bias de 1,91%) comparado
ao kit comercial (método referência), altamente preciso (CV% total de 0,40%, 1,92%, 11,12% em
amostras com 93%, 54% e 2,5% de alelos mutantes, respectivamente) e extremamente sensível
(limite de detecção de 0,16%) com resposta linear variando de 1,16% a 99,98% de alelos
variantes. As amostras de soro foram quantificadas utilizando do método proposto e
apresentaram média de alelos variantes 4% maior comparadas a amostras pareadas de sangue
total-EDTA, o que permitiria aumentos nas taxas de detecção dessa variante e maior robustez
nas análises.