O soro apresenta maior proporção da variante Janus quinase 2 V617F comparado com amostras pareadas de sangue total-edta : um modelo de quantificação para variantes somáticas utilizando qPCR e o método de quantificação relativa 2- ∆∆cq

Abstract

A detecção da variante JAK2 V617F faz parte dos critérios diagnósticos para as neoplasias mieloproliferativas crônicas e proporções elevadas de alelo mutante estão associadas a piores prognósticos. A mutação é geralmente detectada em DNA de amostras de sangue total-EDTA através do método de PCR em tempo real alelo específico (AS-qPCR) e quantificação absoluta. Entretanto, alguns equipamentos de extrações de DNA automatizados co-extraem inibidores de PCR quando partem de sangue total e a quantificação absoluta necessita de um esforço maior para gerar e manter as curvas padrão. A variante JAK2 V617F pode ser detectada em soro através de PCR digital (ddPCR), uma espécime que apresenta menos inibidores quando comparada ao sangue total e é mais amigável aos extratores de DNA automatizados. Entretanto, equipamentos de ddPCR não são amplamente disponíveis como os termocicladores de qPCR. Neste estudo, foi avaliado se a variante patogênica JAK2 V617F pode ser corretamente quantificada por AS-qPCR através do método de quantificação relativa 2-∆∆Cq em DNA de amostras de sangue total-EDTA e validar o teste utilizando protocolos padrão em diagnóstico molecular. Em seguida, o método proposto foi aplicado para avaliar se a mutação pode ser corretamente detectada/quantificada em DNA de amostras de soro. O método proposto mostrou-se altamente exato (bias de 1,91%) comparado ao kit comercial (método referência), altamente preciso (CV% total de 0,40%, 1,92%, 11,12% em amostras com 93%, 54% e 2,5% de alelos mutantes, respectivamente) e extremamente sensível (limite de detecção de 0,16%) com resposta linear variando de 1,16% a 99,98% de alelos variantes. As amostras de soro foram quantificadas utilizando do método proposto e apresentaram média de alelos variantes 4% maior comparadas a amostras pareadas de sangue total-EDTA, o que permitiria aumentos nas taxas de detecção dessa variante e maior robustez nas análises.