Evaluación de la vía P13K y ERK1/2 sobre el control de la alcalinización intracelular inducida por PAF en neutrofilos de bovino
Autor
Smith Ríos, Carlos Víctor Nicolás
Institución
Resumen
En esta tesis, se evaluaron las vías PI3K y ERK1/2 sobre el control de la alcalinización intracelular inducida por PAF, para lo cual se utilizaron inhibidores específicos. Además se evaluó el efecto antagonista de 14-deoxiandrografolido (14-DAP) sobre el cambio de pH intracelular inducido por PAF en neutrófilos de bovino. El factor activante plaquetario (PAF) es un fosfolípido biológicamente activo, producido por una serie de células que incluyen a los leucocitos polimorfonucleares. PAF está implicado en el proceso de inflamación aguda y crónica, produciendo hipotensión, broncoconstricción y aumento de la permeabilidad vascular. Además, PAF estimula una variedad de actividades del neutrófilo incluyendo quimiotaxis, fagocitosis, degranulación, producción de especies reactivas de oxígeno e incremento de pH intracelular. Los neutrófilos de bovino fueron aislados de sangre obtenida por punción de la vena yugular. Las células aisladas fueron preincubadas con BCECF-AM, y la medición de los cambios intracelulares de pH, se realizó mediante espectrofluorimetría. La estimulación con PAF produjo alcalinización intracelular a una concentración de 100 nM, precedida de una acidificación transitoria. Wortmanina en concentraciones 100, 50 y 10 nM, LY294002 en concentraciones 30 y 10 μM (inhibidores específicos de PI3K) y UO126 en concentraciones 1 y 0,1 μM (inhibidor específico de MEK), y Gö6850 en concentraciones 10, 5 y 0,5 μM (inhibidor específico de PKC), inhibieron la alcalinización intracelular inducida por PAF. Por otra parte, 14-DAP a una concentración 25 μM, inhibió el cambio de pH intracelular inducido por PAF. No se observó un cambio significativo en la acidificación intracelular. Se concluye que la estimulación con PAF induce alcalinización intracelular vía activación PI3K-ERK1/2 y PKC. Además, concluimos que 14-DAP reduce la alcalinización inducida por PAF.Palabras claves: Factor activante plaquetario, alcalinización intracelular, neutrófilos, intercambiador Na+/H+, ,MAPK, PI3K, 14-deoxiandrografolido. In this thesis, PI3K and ERK1/2 pathways were evaluated on the control of the intracellular alkalinization induced by PAF, using specific inhibitors for these pathways. In addition ,we evaluated the antagonistic effect of 14-deoxiandrographolide (14-DAP), on the intracellular pH change induced by PAF in bovine neutrophils. Platelet-activating factor (PAF) is a biologically active phospholipid, which is produced by a number of cells, including polymorphonuclear leucocytes. PAF is implied in acute and chronic inflammation processes. Its effects during inflammation include hypotension, bronchoconstriction and increased vascular permeability. Moreover, PAF stimulates a variety of neutrophil activities, including chemotaxis, phagocitosis, degranulation, reactive oxygen species production and intracellular pH increase. Bovine neutrophils were isolated from blood obtained by puncture of the jugular vein. The isolated cells were preincubated with BCECF-AM and the intracellular pH changes was made with at spectrofluorimetric techniques. The stimulation with PAF produced intracellular alkalinization to a concentration of 100 nM, preceded by a transitory acidification. Wortmanin in concentrations of 100, 50 and 10 nM, LY294002 in concentrations 30 and 10 μM (specific inhibitors of PI3K) and UO126 in concentrations 1 and 0.1 μM (specific inhibitor of MEK), and Gö6850 in concentrations 10, 5 and 0.5 μM (PKC inhibitor), inhibited the intracellular alkalinization induced by PAF. On the other hand, 14-DAP at a concentration of 25 mM, inhibited the intracellular pH change induced by PAF. Significant changes in the intracellular acidificación were not observed. It is concluded that the stimulation with PAF induces intracellular alkalinization via activation of PI3K-ERK1/2 and PKC. In addition, we conclude that 14-DAP reduces the alcalinización induced by PAF.