Identificación de segundas señales inducidas por la unión de agonistas solubles a CD40, en queratinocitos humanos
Autor
Gutiérrez Cabrera, Mauricio Andrés
Institución
Resumen
El receptor de membrana CD40 ha sido identificado en varios tipos celulares, entre ellos, los queratinocitos de la epidermis. Su activación con agonistas solubles como por ej. el anticuerpo monoclonal M89, produce en los queratinocitos cambios morfológicos y también en la expresión de proteínas, estos cambios han sido asociados con la inducción de la diferenciación terminal. Para ahondar en este problema, en esta tesis estudiamos la expresión de (pro)filagrina utilizando inmunohistoquímica y la fosforilación de polipéptidos tirosina- y treonina/prolina-dependiente y de MAPK (ERK1/2), así como la expresión de las segundas señales TANK, TRAF6 y TRAF3, mediante Western blotting. Con este objetivo se emplearon queratinocitos de cinco donantes diferentes sometidos a cirugía abdominal reparativa y de antecedentes clínicos conocidos. Las células fueron cultivadas en bajos niveles de Ca+2 y estimuladas con los anticuerpos M89, EA-5, G261.1, la proteína recombinante hCD40L o con IgG1, en presencia o ausencia de IFN-γ. En nuestros ensayos se pudo observar que CD40 indujo en los queratinocitos estudiados un aumento estadísticamente significativo en la expresión de (pro)filagrina, TANK y TRAF3, así como de la fosforilación de proteínas tirosina y treonina/prolina-dependiente. Sin embargo, la estimulación de CD40 inhibió la fosforilación de MAPK y no produjo efectos significativos en la expresión de TRAF6. Estos resultados fueron independientes del empleo de IFN-γ exógeno y en conjunto demuestran que la conjugación de CD40 con agonistas solubles induce, en los queratinocitos humanos, cambios en la fosforilación de proteínas y en la expresión de segundas señales. Estas podrían formar parte de las vías de señalización dependientes de CD40 implicadas en la inducción de la diferenciación de los queratinocitos humanos. The cell surface molecule CD40 has been identified in several cellular types, including human epidermal keratinocytes. CD40-triggering with soluble agonists e.g. M89 antibody, induces morphological changes and protein expression of keratinocytes that have been related with induction of terminal differentiation. Using immunohisto-chemistry, here we evaluated the expression of (pro)filaggrin (a marker of keratinocyte terminal diffrentiation), and using Western blotting tyrosine- and threonine/proline-dependent phosphorylation of polypeptides. Also MAPK (ERK1/2) phosphorylation and TANK, TRAF6 and TRAF3 expression were analyzed. The cells were obtained from five different donors with well-known clinical history and submitted to reparative abdominal surgery. The cells were cultured in low Ca+2 levels and stimulated with the M89, EA-5, G261.1 or IgG1 antibodies and recombinant protein hCD40L in the presence or absence of IFN-γ. Results shown that CD40 triggering induce a statistically significant increase on the expression of (pro)filaggrin, TANK and TRAF3 as well as tyrosine and threonine/proline-dependent phosphorylation. In addition, MAPK ERK1/2 phosphorylation was inhibited and TRAF6 expression remained unchanged. Effects on (pro)filaggrin and second signals were independent of exogenous IFN-γ. As a whole our results demonstrated that in human keratinocytes CD40 triggering with soluble agonists affect protein phosphorylation and second signaling activation. Whereas involvement others than second signals studied here cannot be discarded, CD40-dependent signaling activation could be involved in human keratinocytes differentiation.