Detección molecular del alelo de resistencia a benomilo en cepas de Botrytis cinerea Pers. ex Fr., aisladas de arándano (Vaccinium corymbosum L.)
Autor
Pérez Díaz, Jorge Luis
Institución
Resumen
Se determinó el nivel de resistencia a benomilo en 14 cepas de Botrytis cinerea aisladas desde huertos de arándano ubicados en distintas localidades de Chile. Para esto se utilizaron distintas concentraciones de este compuesto (0; 0,5; 1; 5 y 10µg i.a./mL de medio). Los resultados mostraron que nueve cepas crecieron con la concentración más alta, y las restantes cepas fueron inhibidas en su crecimiento a partir de 0,5 µg i.a. del producto. Mediante la técnica PCR-RFLP y PCR alelo especifica, se analizaron las 14 cepas de B. cinerea. El hongo se cultivó en Agar Papa Dextrosa y luego en Caldo en agitación por 3-4 días. Posterior a esto, el micelio fue filtrado, macerado y se extrajo su ADN para realizar las reacciones PCR. La técnica PCR-RFLP se realizó amplificando un fragmento del gen de la β-tubulina y los productos PCR fueron digeridos con la enzima Bsh con sitio de restricción (5´..CG↓CG... 3´), que genera dos fragmentos en aquellas cepas altamente resistentes a benomilo. Por otra parte, la PCR específica para detectar la misma mutación en el gen de la β-tubulina, se realizó agregando un tercer partidor a los ya existentes. Este es capaz de reconocer en su extremo 3` la mutación, generando un nuevo fragmento de 281pb. Esta segunda técnica resultó ser más eficiente por el tiempo y costo involucrado en el proceso. Los resultados entregados por ambas técnicas moleculares concuerdan que de las 14 cepas analizadas, ocho presentan la mutación de sustitución de una Adenina por Citosina, originando cepas altamente resistentes a benomilo, y las seis restantes no la presentan. Se determinó que todas aquellas cepas que presentaron la mutación crecieron hasta con la concentración más alta del fungicida. Las otras cepas fueron inhibidas en su crecimiento a partir de 0,5µg i.a del producto, y completamente a partir de 5.0µg de i.a. Es necesario mencionar que una cepa que no presentó la mutación se comportó de manera similar a las resistentes, lo que implicaría la existencia de otra posible mutación en el mismo codón u otro codón que le otorga un alto nivel de resistencia. Esto demuestra que la presencia de cepas resistentes a fungicidas en hongos fitopatógenos es cada vez más frecuente en la agricultura, dejando en evidencia la importancia que presenta el manejo integrado como medida de control a fin de evitar el riesgo de aparición de resistencia y la pérdida de control de estos patógenos por parte de dichos compuestos. The level of resistance to benomyl in fourteen Botrytis cinerea strains isolated from orchards of blueberries located in different localities from Chile was determined. For this, different concentrations of this compound (0; 0,5; 1; 5 y 10µg a. i. mL-1 of PDA) were used. Results showed that nine strains grew with the highest concentration. The other strains were inhibited in their grow from 0,5µg a.i. of product. The same fourteen B. cinerea strains were tested by PCR-RFLP and allele-specific PCR markers. B. cinerea was cultivated on Potato Dextrose Agar and Broth on shaking for 3-4 days. Then mycelium was filtered, smashed and its DNA was isolated for PCR´s reactions. PCR-RFLP was made amplifying a fragment of the β-tubulin gene. PCR products were digested using Bsh, with restriction site (3´..CG↓CG..3´), which generates two fragments in highly resistant strains to benomyl. The specific PCR to detect the mutation in the β-tubulin gene, was made adding a third primer to the already existing ones. This primer is able to recognize in its 3´extreme the mutation, giving origin to a new fragment of 281bp. This second technique was more efficient per time and cost involved in the process. The results given for both techniques agree that eight between fourteen characterized strains present the mutation of substitution from adenine to cytosine, originating highly resistant strains to benomyl, and the other six did not have that mutation. It was determined that all strains that presented the mutation, grew normally with the highest concentration of fungicide used. The other strains were inhibited in their growth from 0,5µg a.i. of product and completely from 5µg a.i. It is necessary to mention that one strain that did not present the mutation, it behaved in a similar form to the resistant strains, this would indicate the existence of another possible mutation in the same codon or another codon that confers a high level of resistance. This demonstrates that the presence of strains resistant to fungicides in pathogenic fungi is every frequent in agriculture, leaving in evidence the importance that presents the handling integrated like control measurement in order to avoid the risk of resistance presence and the lost of control of these pathogens on the part of these compounds.