Estudio morfológico y molecular en un modelo de infección por zika durante la neurogénesis embrionaria

Abstract

La enfermedad del virus Zika (ZIKV) ha generado graves problemas en la salud pública desde su aparición en los brotes de las Américas del 2015-2016. Esta enfermedad puede causar trastornos en el neurodesarrollo como microcefalia; una condición que genera, entre otras, disfunciones motoras, visuales, auditivas y cognitivas. A pesar de un gran número de publicaciones sobre la patogénesis del ZIKV aún se desconocen los mecanismos asociados a la infección de las células del sistema nervioso, por ello, el objetivo de este trabajo consistió en evaluar los cambios morfológicos y la participación de marcadores del neurodesarrollo en la infección por virus del Zika durante la neurogénesis embrionaria en un modelo murino. Para cumplir este objetivo se inocularon cinco ratones hembra BALB/c en el estadío temprano de gestación E6,5 por la vía intraperitoneal, con una dosis de interferón y al siguiente día (E7,5) con una dosis de 9,4 x 105 PFU del ZIKV. Se llevó a cabo la eutanasia de las hembras en el estadío embrionario E14,5; momento en donde se da la convergencia para la corticogénesis y cerebelogénesis en el ratón. A continuación, se realizó la extracción de los encéfalos de los embriones para evaluar la expresión de los marcadores del neurodesarrollo (DCX, MCPH1, NES, TBR2, GFAP, CEP-152 y RELN) y para ensayos histológicos e inmunohistoquímicos únicamente en el tejido cerebral. En la evaluación de expresión de los marcadores de neurodesarrollo evaluados se encontró que la infección por ZIKV altera significativamente la expresión de DCX, CEP-152, TBR2 y RELN proteínas cruciales para el desarrollo cortical y cerebelar. Además, en los resultados obtenidos de inmunohistoquímica e hibridación in situ observamos que las regiones con más antígeno y ARN de replicación del ZIKV fueron el mesencéfalo, rombencéfalo y médula espinal, regiones donde también encontramos un mayor número de alteraciones asociadas a procesos morfológicos relacionados a procesos de degeneración celular y marcación positiva para caspasa. Por otro lado, se realizaron ensayos de acoplamiento molecular entre las proteínas seleccionadas para el proyecto (DCX, MCPH1, CEP152, RELN, TBR2, GFAP y NES) con las proteínas de replicación NS4A y NS5 del ZIKV y se encontraron energías de interacción favorables para MCPH1, RELN, DCX y TBR2 con NS4A del ZIKV. Con este trabajo se concluye que el virus zika genera alteraciones morfológicas como la aparición de núcleos picnóticos altamente asociadas a la presencia y replicación viral del mismo. Se reporta por primera vez cambios en la expresión de marcadores del neurodesarrollo cortical y cerebelar asociados a la infección por el ZIKV como MCPH1, CEP-152, RELN, TBR2, además, este estudio es el primer reporte en donde se evidencia interacción molecular entre las proteínas del neurodesarrollo MCPH1, DCX, RELN y TBR2 con la proteína de replicación viral NS4A. Estos resultados postulan a los genes evaluados como posibles blancos de unión al ZIKV y permiten plantear futuros mecanismos de infección por el ZIKV. (Texto tomado de la fuente).

Zika virus disease (ZIKV) has generated serious public health problems since its appearance between 2015–2016 years of outbreaks in the Americas. This disease can cause neurodevelopmental disorders such as microcephaly; a condition that generates, among others, motor, visual, auditory and cognitive dysfunctions. Despite numerous publications on the pathogenesis of ZIKV, the mechanisms associated with the infection of nervous system cells are still unknown. Therefore, this study evaluated the morphological changes and the participation of neurodevelopmental markers in ZIKV infection during embryonic neurogenesis in a murine model. To accomplish this objective, five female BALB/c mice at early gestational stage E6.5 were inoculated intraperitoneally with a dose of interferon and the following day (E7.5) with a 9.4 x 105 PFU dose of ZIKV. The females were euthanized at the E14.5 embryonic stage, when the convergence for corticogenesis and cerebellogenesis occurs in the mouse. Then, the embryos' brains were extracted to evaluate the expression of neurodevelopmental markers (DCX, MCPH1, NES, TBR2, GFAP, CEP-152 and RELN) and for histological and immunohistochemical assays only in brain tissue. In the evaluation of expression of the neurodevelopmental markers evaluated, it was found that ZIKV infection significantly alters the expression of DCX, CEP-152, TBR2 and RELN proteins crucial for cortical and cerebellar development. Additionally, in the results obtained from immunohistochemistry and in situ hybridization, we observed that the regions with more antigen and replication RNA of ZIKV were the midbrain, hindbrain and spinal cord, regions where we also found a greater number of alterations associated with morphological processes related to processes of cell degeneration and positive labeling for caspase. By the other hand, molecular docking assays were performed between the proteins selected for the project (DCX, MCPH1, CEP152, RELN, TBR2, GFAP and NES) with the replication proteins NS4A and NS5 of ZIKV and favorable interaction energies were found for MCPH1, RELN, DCX, and TBR2 with NS4A of ZIKV. This work concludes that the Zika virus generates morphological alterations such as the appearance of pyknotic nuclei, highly associated with the presence and viral replication of the virus. We report for the first time changes in the expression of cortical and cerebellar neurodevelopmental markers associated with ZIKV infection such as MCPH1, CEP-152, RELN, TBR2, in addition, this study is the first report where the molecular interaction between the neurodevelopmental proteins MCPH1, DCX, RELN, and TBR2 with the viral replication protein NS4A is evidenced. These results postulate the genes evaluated as possible binding targets for ZIKV and allow us to consider future mechanisms of ZIKV infection.