Evaluación de la posible presencia de un complejo macromolecular de fototransducción en la retina del calamar Doryteuthis pealeii

Abstract

Como resultado de fuerte presión evolutiva, los sistemas visuales han desarrollado increíble sensibilidad y rapidez, con reportes en fotor receptores microviliares de detección de fotones únicos y de latencias de fotorrespuesta del orden de ~ 15 ms . Sin emb argo , est as características son incompatibles entre sí , pues la amplificación requerida para tener alta sensibilidad im p lica una fuerte limitante temporal debido a que los efectores de la cascada de foto transducción deb en difundir hacia sus su stratos, lo que excluiría necesariamente la posibilidad de una fotorrespuesta rápida . Hasta h oy, l a única posible solución al problema ha surgido con la proteína InaD presente en los fotor r eceptores microviliares de Drosophila , un andamio que nuclea diferentes elementos de la cascada de fototransducción en un complejo macromolecular o “ transducisoma ” . Aunque este diseño daría cuenta de las rá pidas foto r respuestas , pues permitiría minimizar los tiempos de difusión de los efectores de la cascada , el que sea estático hace que se quede corto frente a varias piezas de evidencia , la más notoria siendo el hecho de que los foto rreceptores se adaptan a las condiciones de luz , presentando una fotorrespuesta de alta ganancia y cinética lenta en condiciones de baja luz , opuesta a la respuesta rápida y de baja ganancia que ocurre en condiciones de alta luz. En el presente trabajo , examinamos el calamar Doryteuthis pealeii , cuyo lina je divergió del de Drosophila hace ~650 millones de años , pero que posee fotorreceptores r ápidos d el mismo tipo . A nticuerpos contra la f o sfolipasa C – enzima central a la cascada de fototransducción en fotorreceptores microviliares – de la retina del calamar , fueron validados por Western blot e inmunohistoquímica, y en ensayos de co - inmunoprecipitación halaban la enzima junto con otras proteínas en patrones de bandas de gel replicables . En algunas d e estas bandas se identificaron, mediante a nálisis de espectrom etría de masas , elementos clave de la cascada de fototransducción, incluyendo rodopsina quinasa, rodopsina, proteí na Gq y canal TRP , al igual que elementos del citoesqueleto submembranal de la célula . C omprobamos as í la existencia de un c o mplejo de foto transducci ó n en una especie filogenéticamente distante de Drosophila , lo que sugiere la antigüedad y conservación del diseño . A demás, los patrones de bandas de proteínas co - inmunoprecipitadas cambiaban cuando la [ Ca 2+ ] – cuyo nivel citosó lico está implicado en la adaptación a la luz en f otor receptores micro viliares – era fuertemente tamponada , implicando la modulabilidad del complejo por calcio y abriendo la posibilidad de reconciliar mecanísticame nte la rapidez de la fotor r espuesta con el fenómeno de adaptación a la luz. Adicionalmente, clonamos varios elementos de l a cascada de fototransducci ó n y dos andamios putativos y los insertamos en vectores de expresión, con miras a futuros análisis in vitro o en sistem as heterólogos que permitan determinar las interacciones exactas entre los elementos que participan del complejo.

Abstract: As a result of strong selection, visual systems have developed great sensitivity and speed, with reports in microvilliary photo receptors of single - photon detection and photor esponse latencies of ~15 ms. However, these features are incompatible with one another, for the amplification required for high sensitivity entails a strong temporal limitation, due to the fact that the effectors of the phototransduction cascade have to diffuse to their substrates, which necessarily precludes the possibility o f a fast photorespons e . T o this day, the only possible solution to the problem has arisen with the InaD protein of the microvilliary photoreceptors of the fly Drosophila , a scaffold protein that nucleates different elements of the phototransduction cascade in to a macromolecular complex or transducisom e . Albeit this design would account for the rapid photoresponses, s i nce it would allow to minimize the diffusion times of the eff ectors of the cascade, the fact that it be static makes it fall sho rt in light of several pieces of evidence, the most salient being that photoreceptors sh o w adaptation to light conditions, d i splaying a high - gain, low - speed photoresponse u n der low - light conditions , opposite from the fast, lo w - gain photoresponse that occurs under high - light conditions. In the present work , we examined the squid Doryteuthis pealeii , w hose lineage diverged from Drosophila ’ s nearly ~ 650 million years ago, but possesses the f ast photoreceptors of the same kind . A ntibodies raised against the p h osp holipase C – a pivotal enzyme in the phototransduction cascade of m i crovilliary photoreceptors – of the s quid retina , were validated by Western blot and immunohistochemistry , and in co - immunoprecipitation assays , they pulled the enzyme along with other prote ins in replicable gel band patterns. By means of mass spectrometr y analysis of some bands , key elements of the phototransduction cascade were identified, including rhodopsin e kinase, rhodopsine, protein Gq and TRP channel, as well a s proteins of the submembranal cytoskeleton of the cell. T h us, we proved the existence of a p h ototransduction complex in a phylogenetically distant species from Drosophila , which suggests the antiquity and conservation of this design. M or eover, the co - immunoprecipitation band patterns changed when [ Ca 2+ ] – whose cytosolic level plays a role in adaptation to light in microvilliary photoreceptors – was strongly buffe red, which implied the modulab i lity of the complex by calcium and o f fered the possibility to mechanistically reconcil e the speed of the photorespon se with the phenomenon of adaptation to light. A dditionally, we cloned several elements of the phototransduction cascade and two putative scaffolding proteins, and inserted them into expression vectors, establishing the basis for future protein - prot ein interaction assays, whether in vitro or in heterologous systems, in order to determine the exact interactions among the elements that participate in the complex.