Comparación de la especificidad y capacidad neutralizante de dos antivenenos antiofídicos retados con veneno de serpiente del género Bothrops de Colombia

Abstract

Introduction. In Colombia the antivenom against snakebite from the National Institute of Heatlh (INS) and the antivenom from the Bioclon Intitute, belonging to Laboratorios Silane of Mexico, Antivipmyn-Tri (AVP-T), but neither includes venom of Bothrops rhombeatus species for their production. Objective. The aim of this research was to evaluate the neutralizing capacity, specificity and affinity of INS and AVP-T antivenoms with B. rhombeatus venom, using the Bothrops asper and Bothrops atrox venom as a reference and control for the experiments. Methods. The research was carried out in the Instrumental Analysis Laboratory of the Institute of Biotechnology of the Universidad Nacional de Colombia, and in the Toxins Analysis Laboratory of the Institute of Biotechnology of the Universidad Nacional Autónoma de México. The test in mice were analyzed with albinos Mus musculus CD1 weighing between 18-20 g intraperitoneally (IP). Venom proteins and antivenoms were quantified by Absorbance 280 nm, Bradford method and Bicinchoninic acid (BCA). Polyacrylamide gel electrophoresis was performed in the presence of sodium duodecyl sulfate (SDS-PAGE) and reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) to analyze the protein profile. The mean lethal dose (LD50) of the venom and the mean effective dose (ED50) of the antivenoms were calculate. The immunochemical specificity and affinity of the antivenoms for the venom were evaluated with affinity chromatography, Western Blot, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and SDS-PAGE of the fractions coupled to each antivenoms. Results. The B. rhombeatus´s LD50 was 6,6 mg/kg, of B. asper was 6,4 mg/kg and of B. atrox was 6,7 mg/kg. The INS´s ED50 was 119,7 g/3LD50 and AVP-T´s ED50 was 270 g/3LD50 with B rhombeatus venom. Compared with B. asper venom, the INS´s ED50 was 62,74 g/3LD50 and AVP-T´s ED50 was 143,8 g/3LD50, and with B atrox venom the INS´s ED50 was 75,15 g/3LD50 and AVP-T´s ED50 was 190,2 g/3LD50. The electrophoretic profile and the chromatogram fractions of the venom was correlated, suggesting phospholipases A2 (PLA2), metalloproteinases (svMP) type I, II, III and serinoproteases (SP) in B. rhombeatus venom. Similarities of high, medium and low molecular weight protein were found between the profile of the three venoms with bands between 50-70 KDa corresponding to svMP III, band around 20-25 KDa of svMP I and between 11-15 KDa of PLA2. Both antivenoms showed immunochemical recognition towards PLA2 and svMP but at different intensity. INS showed recognition to svMP III fractions of B. atrox venom, same as towards svMP I and III of B. rhombeatus venom and svMP I, II and III fractions of the B. asper venom. Unlike INS, AVP-T showed immunochemical recognition to SP of B. rhombeatus venom and almost all the svMP fractions of B. asper venom, with higher intensity to svMP III and PLA2 of B. atrox venom. The quantification of antibodies coupled was for INS to B. rhombeatus was 94,2% and to B. asper venom was 92,7%; while AVP-T had 90,4% coupling to B rhombeatus and 96,6% to B. asper venom. These results are consistent with the ED50, because both antivenoms were effective to neutralize the lethality of the B. rhombeatus venom, however, considering neither was developed with this venom, thus inferring cross-reactivity towards PLA2 and svMP. All the above, were corroborated with the recognition level of the ELISA test, which it is evident that more INS antivenom was required to reach half of the maximum response with the B. rhombeatus venom compared to AVP-T. Conclusion. The results obtained suggest that both antivenoms may be a therapeutic option to the treatment of snakebite caused by B. rhombeatus, however, beyond that there is the fact is necessary to improve the specificity of commercial antivenoms, so that they are more related to the venom´s fractions with a significant effect on the pathophysiology of the patient, which would allow ophidiotoxicosis to be more easily neutralized without requiring a large amount of antivenoms and reducing secondary reactions to excess heterologous plasma immunoglobulins.

Introducción. En Colombia se comercializa el antiveneno antiofídico polivalente del Instituto Nacional de Salud (INS) y el antiveneno del Instituto Bioclon, perteneciente a Laboratorios Silanes de México, denominado Antivipmyn-Tri (AVP-T), siendo relevante que ninguno incluye para su elaboración el veneno de la especie Bothrops rhombeatus. Objetivo. El objetivo de esta investigación fue evaluar la capacidad neutralizante, especificidad y afinidad de los antivenenos INS y AVP-T al veneno de Bothrops rhombeatus, utilizando como referente y control para los experimentos el veneno de Bothrops asper y de Bothrops atrox. Métodos. La investigación se desarrolló en el Laboratorio de Análisis Instrumental del Instituto de Biotecnología perteneciente a la Universidad Nacional de Colombia y en Laboratorio de Análisis de Toxinas del Instituto de Biotecnología, de la Universidad Nacional Autónoma de México. Los ensayos con murinos se realizaron con ratones albinos Mus musculus CD1 con peso entre 18-20 g, por vía intraperitoneal (IP). Se cuantificaron las proteínas del veneno y los antivenenos por Absorbancia a 280 nm, método de Bradford y Ácido Bicinconínico (BCA). Se realizó electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de Duodecilsulfato de Sodio (SDS-PAGE) y cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC) para analizar el perfil proteico. Se calculó la Dosis Letal Media (DL50) del veneno y la Dosis Efectiva Media (DE50) de los antivenenos. Se evaluó la especificidad y afinidad inmunoquímica de los antivenenos hacia el veneno con cromatografía de afinidad, Western Blot, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y SDS-PAGE de las fracciones acopladas a cada uno de los antivenenos. Resultados. Dentro de los resultados se encontró una DL50 para el veneno de B. rhombeatus de 6.6 mg/kg, para B. asper fue de 6.4 mg/kg y para B atrox de 6.7 mg/kg. La DE50 para INS fue de 119.7 g/3DL50 y para AVP-T de 270.2 g/3DL50 con el veneno de B. rhombeatus. Comparado con el veneno de B asper la DE50 para INS fue de 62,74 g/3DL50, para AVP-T de 143,8 g/3DL50, mientras que con el veneno de B atrox DE50 para INS fue de 75,15 g/3DL50 y para AVP-T de 190,2 g/3DL50. Se correlacionó el perfil electroforético y las fracciones del cromatograma del veneno sugiriendo en el veneno de B. rhombeatus la presencia de fosfolipasas A2 (PLA2), Metaloproteinasas (svMP) tipo I, II y III y serinoproteasas (SP). Se encontraron similitudes entre los perfiles de los venenos de B. rhombeatus, B. asper y B. atrox, de los componentes proteicos de alto, medio y bajo peso molecular con bandas entre 50-70 KDa correspondientes a svMP III, bandas alrededor de 20-25 KDa de svMP I y bandas entre 11-15 KDa de PLA2. Se encontró que ambos antivenenos mostraron reconocimiento inmunoquímico hacia PLA2 y svMP pero en diferente intensidad. El antiveneno INS mostró reconocimiento de las fracciones de svMP III del veneno de B atrox; al igual que hacia svMP I y III del veneno de B. rhombeatus y las fracciones svMP I, II y III del veneno de B. asper. A diferencia del INS, AVP-T si presentó reconocimiento inmunoquímico a SP del veneno de B. rhombeatus y a casi todas las fracciones de svMP del veneno de B asper, mostrando mayor intensidad a svMP III y PLA2 del veneno de B atrox. La cuantificación de anticuerpos específicos del INS acoplados al veneno de B. rhombeatus fue de 94,2%; hacia el veneno de B. asper fue de de 92,7%; mientras que AVP-T tuvo un acoplamiento del 90,4% hacia B. rhombeatus y de 96,6% al veneno de B asper. Estos datos son concordantes con la capacidad neutralizante, donde AVP-T fue tan eficaz como INS para neutralizar la letalidad del veneno de B. rhombeatus, sin embargo, cabe resaltar que ninguno fue desarrollado con este veneno, por lo que se infiere una reactividad cruzada hacia PLA2 y svMP. Todo lo anterior fue corroborado con el nivel de reconocimiento de la prueba ELISA, donde se evidenció que se requirió más antiveneno INS para alcanzar la mitad de la respuesta máxima con el veneno de B. rhombeatus comparado con AVP-T. Conclusiones. Los resultados obtenidos sugieren que ambos antivenenos pueden ser una opción terapéutica para tratar los envenenamientos causados por esta especie, sin embargo, más allá, está el hecho de comprender que es necesario mejorar la especificidad de los antivenenos comerciales, para que sean más afines a las fracciones de los venenos con efecto significativo en la fisiopatología del paciente, lo que permitiría neutralizar más fácilmente la ofidiotoxicosis sin requerir una gran cantidad de antiveneno y disminuir las reacciones secundarias al exceso de inmunoglobulinas heterólogas en plasma.