Identification of Dictyopanus pusillus as a promising candidate for enzymatic lignocellulose pretreatment of oil palm tree residues

Abstract

Basidiomycete fungi are the most important organisms involved in wood recycling in nature trough production of ligninolytic enzymes able to degrade lignocellulose to obtain energy. Bioprospection of basidiomycete fungi and their ligninolytic enzymes is a valuable asset for the development of biotechnological delignification processes. Now, lignocellulolytic residue accumulation has been increasing over the years due to worldwide population growth and lignocellulose is one of the most promising renewable sources for bioethanol production. It encourages the use of by-products derived from the agro-industry as a practical alternative strategy for handling the accumulation of waste products with high energetic value. Bioethanol production using lignocellulose necessitates a selective pretreatment removing lignin to release cellulose and hemicellulose, which are then hydrolyzed to obtain sugars that can then be fermented to produce ethanol. Until now, the pretreatment process is the only step that has been supported by an effective biotechnological strategy, and still depends on chemicals or high energy demand strategies. Enzymatic pretreatment of lignocellulose would be a green alternative for the delignification process that occurs within cellulosic ethanol industry. Among basidiomycete oxido-reductase enzymes, peroxidases, such as lignin peroxidases, manganese peroxidases and versatile peroxidases, and catalases as laccases are ligninolytic enzymes that oxidize lignin present in wood that could offer an environmental-friendly alternative for the exploitation of lignocellulosic by-products. Various agroindustries generate such by-products but oil palm (Elaeis guineensis) is the principal source of oil in the world, with Malaysia and Indonesia being the main producers followed by Nigeria, Thailand and Colombia. This specific culture generates important quantities of residues and for instance for Colombia, it means that in 2014 from 1.1 million tons of palm oil obtained, 3.3 million tons of wastes were generated. Thus, the objective of this research project was to perform bioprospection of white-rot native Colombian basidiomycete fungi with ligninolytic activity and explore their genome to identify enzymes capable of handling the pretreatment of palm oil tree lignocellulosic residues. Selection of basidiomycete fungi with ligninolytic activity was achieved using Solid State Fermentation and delignification capacity of enzymatic extracts was evaluated over lignocellulose from oil palm. It arose from this study that the isolation of a Colombian native Dictyopanus pusillus-LMB4 basidiomycete fungus showed a relevant laccase activity (267.6 U.L-1 after 28 days of fermentation). Interestingly, this specie had not yet been reported as an efficient ligninolytic organism. Enzymatic crude extract with laccase activity from native D. pusillus-LMB4 was used for a pretreatment process of empty fruit bunches lignocellulose to obtain reducing sugars. Ligninolytic protein characterization, mainly laccases, of this enzymatic crude extract showed the presence of at least one enzyme with laccase activity by zymogram analysis and mass spectrometry peptide identification. Genomic exploration of D. pusillus-LMB4 revealed the existence of 14 genes that have similarity with other reported laccase enzymes. To our knowledge this work presents the first genomic exploration of a Dictyopanus species with an emphasis on laccase enzymes that could be used for lignocellulose pretreatment during cellulosic ethanol production and bioremediation of soils and wastewaters, among others. Hence, these results report Dictyopanus pusillus-LMB4 as a new ligninolytic species, and its laccase enzymes as possible future green alternatives for the pretreatment of lignocellulose biomass from the agroindustry.

Los hongos basidiomicetos son los organismos más importantes en el reciclaje de la madera en la naturaleza a través de la producción de enzimas ligninolíticas capaces de degradar lignocelulosa para la obtención de energía. La bioprospección de hongos basidiomicetos y sus respectivas enzimas ligninolíticas son de gran valor para el desarrollo del proceso biotecnológico de deslignifcación. Actualmente la acumulación de residuos ligninolíticos ha incrementado en los últimos años, como consecuencia del crecimiento de la población mundial, siendo la lignocelulosa una de las más prometedoras fuentes renovables para la producción de bioetanol. Lo anterior incentiva el uso de subproductos provenientes de la agroindustria como una alternativa estratégica para el manejo y la acumulación de productos de desecho de alto valor energético. Para la producción de bioetanol es necesario un pretratamiento para la remoción de la lignina y así permitir la liberación de la celulosa y hemicelulosa, que permite la hidrolisis de estos carbohidratos para la obtención de azúcares que finalmente son fermentados para la producción de etanol. Hasta el momento, el pretratamiento es la única etapa que no ha sido soportada por una estrategia biotecnológica efectiva, dependiendo de compuestos químicos o procesos que demandan alta energía. El pretratamiento enzimático de la lignocelulosa podría ser una alternativa verde para el proceso de deslignificación en la industria del bioetanol celulósico. Entre las enzimas de los hongos basidiomicetos se encuentran peroxidasas como manganeso peroxidasas, lignina peroxidasas y versátil peroxidasas, y catalasas como las lacasas, estas enzimas ligninolíticas son capaces de oxidar la lignina presente en la madera, ofreciendo una alternativa amigable con el medio ambiente para la explotación de subproductos lignocelulósicos. Existen varias agroindustrias que generan subproductos lignocelulósicos, un ejemplo es la industria de la palma aceitera (Elaeis guineensis), que es la principal fuente de aceite a nivel mundial, siendo Malasia e Indonesia los mayores productores de aceite, seguidos por Nigeria, Tailandia y Colombia. El cultivo de palma genera importantes cantidades de residuos, como sucede en Colombia, donde se produjeron 1.1 millones de toneladas de aceite de palma, generando 3.3 millones de toneladas de desechos lignocelulósicos para el año 2014. Con base a lo anterior, el objetivo de este proyecto de investigación fue realizar la bioprospección de hongos basidiomicetos nativos colombianos con actividad ligninolítica y explorar su genoma para identificar enzimas con la capacidad de realizar el pretratamiento de residuos lignocelulósicos de la palma aceitera. Aislamiento y selección de hongos basidiomicetos con actividad ligninolítica fueron logrados por medio de fermentación en estado sólido, al igual que la capacidad ligninolítica de los extractos enzimáticos obtenidos sobre lignocelulosa de palma aceitera. Como resultado de esta investigación se obtuvo el hongo basidiomiceto colombiano Dictyopanus pusillus-LMB4, el cual mostró una relevante actividad lacasa, interesantemente, esta especie no ha sido aún reportada como un eficiente organismo ligninolítico. El extracto enzimático crudo con actividad lacasa del asilamiento nativo D. pusillus-LMB4 fue usado para el pretratamiento de lignocelulosa de racimos vacíos de palma aceitera para la obtención de azúcares reductores; la caracterización de las proteínas de este extracto enzimático crudo mostró la presencia de al menos una enzima con actividad lacasa; la exploración genómica de D. pusillus-LMB4 mostró la existencia de 14 genes que poseen similitud con otras enzimas lacasas reportadas. A nuestro conocimiento esté trabajo muestra la primera exploración genética de una especie de Dictyopanus con énfasis en enzimas lacasas. Enzimas que podrían para el pretratamiento de lignocelulosa en la producción de etanol celulósico. Por consiguiente, estos resultados reportan a la especie Dictyopanus pusillus como un nuevo organismo lignolítico y sus enzimas lacasas como una posible alternativa verde para el pretratamiento de biomasa lignocelulósica de la agroindustria.