Péptidos análogos a Catelicidinas: potencial actividad e interacción con la envoltura celular de las micobacterias

Abstract

La tuberculosis (TB) es la enfermedad bacteriana que causa el mayor número de muertes en todo el mundo. El problema se incrementa debido a la resistencia a medicamentos y a la coinfección por VIH/SIDA, por lo que es necesario el desarrollo de nuevos compuestos contra la TB que presenten diferentes mecanismos de acción. Los péptidos antimicrobianos son moléculas generadas en la respuesta inmune innata del hospedero con efecto sobre patógenos, como las catelicidinas presentes en mamíferos involucradas en la formación de canales en la membrana celular bacteriana que conduce a la lisis celular. En este estudio, se evaluó la actividad antimicobacteriana y el posible mecanismo de acción de péptidos derivados de LL-37, CAP-18 y PMAP-36 con aminoácidos no naturales. A partir de métodos bioinformáticos, se determinó la epítope de la secuencia nativa con las mejores características de estructura helicoidal, anfipaticidad y valor antibacteriano. Los péptidos correspondientes LL37-B, CAP18-B, CAP18-C, PMAP36-C y PMAP36-D tuvieron cambios de L-Lys por D-Lys y L-Gly por N-metil-Gly en la secuencia, generando los péptidos LL37-BD, CAP18-BD, CAP18-CD, PMAP36-CD y PMAP36-DD, y los peptoides LL37-BP, CAP18-BP y PMAP36-CP. Los péptidos y peptoides se sintetizaron usando la estrategia de Fmoc, se purificaron por RP-HPLC y se caracterizaron por ESI-MS, dicroísmo circular y H1-RMN. La evaluación in vitro de las secuencias diseñadas se realizó en Mycobacterium smegmatis mc2155 y Mycobacterium tuberculosis H37Ra, obteniendo una concentración mínima inhibitoria mejorada de 2 a 6 veces en los rangos de 1200 a 31,2 µg/mL, actividad hemolítica menor al 10% y sin actividad citotóxica sobre monocitos U937 con valores de LC50 al menos 10 veces mayores a la CMI. La microscopía confocal mostró la inserción de los péptidos y peptoides en Mycobacterium smegmatis mc2155 lo que sugiere que podrían tener un blanco intracelular para su actividad antimicobacteriana e interesantemente mostraron inhibición de la actividad ATPasa basal y de las bombas Na+/K+, Cu(I), Zn(II) presentes en la membrana plasmática, lo cual estaría asociado a su mecanismo de acción. En general, los péptidos con D-Lys presentaron mayor actividad biológica y sinergia en combinación con isoniacida y kanamicina, destacando los péptidos CAP18-CD y PMAP36-DD que presentaron los mejores resultados evaluados en Mycobacterium y células del hospedero, por lo cual, se analizaron mediante dinámica molecular, donde los ángulos promedio de psi y phi, así como su varianza circular muestran que ambos péptidos tienen una flexibilidad conformacional sustancial, característica muy importante para mejorar la actividad antibacteriana. Los resultados obtenidos contribuyen al campo de desarrollo de nuevos compuestos antituberculosos con un mecanismo de acción diferente a los medicamentos convencionales.

Abstract: Tuberculosis (TB) is the bacterial disease that causes the greatest number of deaths worldwide. The problem is exacerbated due to drug resistance and HIV/AIDS co-infection, meaning it is necessary to develop new anti-tuberculosis compounds with an alternative action mechanism. The antimicrobial peptides are molecules which are created in the innate inmune and the response to pathogen agent, such as the cathelicidins present in mammals and involved in the formation of channels in the bacterial cell membrane that leads to cell lysis. In this study, the antimycobacterial activity and the possible mechanism of action of peptides derived from LL-37, CAP-18 and PMAP-36 with non-natural amino acids are evaluated. From bioinformatic methods, the epitope of the native sequence was determined with the best characteristics of the helical structure and the antibacterial value. The corresponding peptides LL37-B, CAP18-B, CAP18-C, PMAP36-C and PMAP36-D had changes in L-Lys by D-Lys and L-Gly by N-methyl-Gly in the sequence, generating the peptides LL37-BD, CAP18-BD, CAP18-CD, PMAP36-CD and PMAP36-DD, and the peptoids LL37-BP, CAP18-BP and PMAP36-CP. Peptides and peptoids were synthesized by the Fmoc strategy, purified by RP-HPLC and characterized by MS-ESI, circular dichroism and H1 -NMR. The in vitro evaluation of the designed sequences was performed in Mycobacterium smegmatis mc2155 and Mycobacterium tuberculosis H37Ra, obtaining an improved minimum inhibitory concentration of 2 to 6 times in the ranges of 1200 to 31.2 µg/mL, hemolytic activity less than 10% and without cytotoxic activity on U937 monocytes with LC50 values at least 10 times higher than the MIC. The confocal microscopy showed the insertion of peptides and peptoids in Mycobacterium smegmatis mc2155, which must have an intracellular target for antimycobacterial activity and interesting showed inhibition of basal ATPase activity and Na+ /K+ , Cu(I), Zn (II) pumps in the plasma membrane, which is associated with its action mechanism. In general, the peptides with D-Lys showed an improved biological activity and synergy with the combination of isoniazid and kanamycin, highlighting the peptides CAP18-CD and PMAP36-DD that the best results evaluated in Mycobacterium and host cells, therefore, they were analyzed by molecular dynamics, where the average angles of psi and phi, as well as their circular variance shown by both peptides have a conformational flexibility, a very important characteristic to improve antibacterial activity. The results are related to the field of development of new antituberculous compounds with a mechanism of action different from current medications.