Visualization of the mechanosensory machinery in live mammalian auditory hair cells

Abstract

The inner ear detects sound-induced vibrations through deflection of rigid projections at the apex of mechanosensory hair cells, known as stereocilia. Stereocilia of a hair cell form the “hair bundle”. Sound is detected when stereocilia are deflected and tug on tiny extracellular tip links that gate mechanotransduction channels. Any study of the potential dynamic changes within this mechano-electrical transduction (MET) machinery is currently challenging due to small sizes of their components, in a range of 5-200 nm. Conventional label-free optical microscopy has a best resolution of ~200 nm. Therefore, it is impossible to visualize the MET apparatus in live cells. Super-resolution imaging has been only of a limited use due to the requirement of fluorescent labeling. Therefore, ultrastructural details of the MET apparatus in the auditory hair cells have been investigated mostly with electron microscopy (EM). Unfortunately, EM techniques require chemical or cryofixation of the sample, making the study of dynamic processes in the MET machinery nearly impossible or extremely labor intensive. In theory, scanning probe techniques, such as atomic force microscopy (AFM), have enough resolution to visualize ultrastructural details in live cells. However, the efforts to image hair cell bundles with AFM were not too encouraging, since stereocilia bundles are usually damaged after even the slightest contact of the AFM probe with them. The hopping probe ion conductance microscopy (HPICM) is an alternative non-contact scanning probe technique capable of performing time lapse imaging of the surface of live cells with a complex topography, with single nanometer resolution and without making physical contact with the sample. The HPICM uses an electrical current passing through a glass nanopipette to detect the cell surface in close vicinity to the pipette, while a 3D-positioning piezoelectric system scans the surface and generates its image. The goal of this project was to optimize HPICM for visualization of nanoscale structures on the surface of the stereocilia in live auditory hair cells. We were able to visualize stereocilia bundles in live inner hair cells including the links interconnecting stereocilia (~5 nm in diameter). We were also able to obtain time-lapse imaging of these bundles. We believe that this is an important step toward our goal of studying ultrastructural changes in the mechanosensory machinery of live hair cells with HPICM.

El oído interno detecta vibraciones inducidas por el sonido a través de la desviación de proyecciones rígidas en la superficie apical de las células ciliadas mecanosensoriales, conocidas como estereocilios. Los estereocilios de una célula ciliada forman el "haz de cilios". El sonido se detecta cuando los estereocilios se desvían y tiran de unas pequeñas uniones extracelulares que abren los canales de mecano-transducción. El estudio de posibles cambios dinámicos de la maquinaria de transducción mecano-eléctrica (MET) es actualmente un desafío, debido al tamaño de sus estructuras, en un rango de 5-200 nm. La microscopía óptica convencional sin etiquetas fluorescentes (fluorescent tags) tiene una resolución máxima de ~ 200 nm. Debido a esto, es imposible visualizar el aparato MET en células vivas. Por otro lado, la microscopia de superresolución ha tenido un uso limitado debido a que es necesario el uso de moléculas fluorescentes. Por lo tanto, los detalles ultraestructurales del aparato MET en las células ciliadas auditivas se han investigado principalmente con microscopía electrónica (EM). Desafortunadamente, las técnicas EM requieren de fijación química o criogénica de la muestra, lo que hace que el estudio de los procesos dinámicos en la maquinaria MET sea casi imposible o extremadamente laborioso. En teoría, las técnicas de exploración con sonda, como la microscopía de fuerza atómica (AFM por sus sigla en inglés), tienen suficiente resolución para visualizar detalles ultraestructurales en células vivas. Sin embargo, los esfuerzos para obtener imágenes de los haces de células ciliadas con AFM no han sido demasiado alentadores, ya que los haces de estereocilios generalmente se dañan al mínimo contacto con la sonda de AFM. Como alternativa, la microscopía de conductancia iónica con sonda de salto (HPICM por sus sigla en inglés) es una técnica de sonda de exploración sin contacto capaz de realizar imágenes de lapso de tiempo (time lapse) de la superficie de células vivas con una topografía compleja, con una resolución de un solo nanómetro y sin hacer contacto físico con la muestra. El HPICM utiliza una corriente eléctrica que pasa a través de una nanopipeta de vidrio para detectar la superficie de la célula en las proximidades de la pipeta, mientras que un sistema piezoeléctrico de posicionamiento 3D escanea la superficie y genera su imagen. El objetivo de este proyecto fue optimizar el HPICM para la visualización de estructuras a nanoescala en la superficie de los estereocilios en células ciliadas auditivas vivas. Se lograron visualizar haces de estereocilios en células ciliadas internas vivas, incluidos los enlaces que interconectan los estereocilios (~ 5 nm de diámetro). También se pudieron obtener imágenes de lapso de tiempo de estos haces de cilios. Se considera, que este es un paso importante hacia el objetivo de estudiar los cambios ultraestructurales en la maquinaria mecano-sensorial de las células ciliadas vivas con HPICM. (texto tomado de la fuente)