Posibles uniones entre proteínas relacionadas con la vía PPARγ – NFκB y proteínas no estructurales de rotavirus

Abstract

Rotavirus es un virus perteneciente a la familia Reoviridae, icosaédrico sin envoltura; su cápside está constituida por tres capas: externa, media e interna. Mide aproximadamente 70 nm de diámetro, su genoma de 11 segmentos de ARN de doble-cadena codifica para seis proteínas estructurales (VP) y seis proteínas no estructurales (NSP). OBJETIVO GENERAL: Determinar la unión de las proteínas no estructurales de Rotavirus (NSP1-6) con proteínas de la vía PPARγ – NFκB. METODOLOGÍA: Se evaluó la expresión de proteínas celulares relacionadas con las vías NFκB y PPARγ, mediante las técnicas de ELISA, luminiscencia, citometría de flujo y Western blot, en células MA104 infectadas con Rotavirus y/o transfectadas con cada uno de los plásmidos que expresan para proteínas NSPs. La unión entre proteínas celulares y virales (NSPs) se examinó por las técnicas de ELISA, Epi-fluorescencia y microscopia confocal. RESULTADOS: La expresión de las proteínas p-IKKα/β, NFκB, p-NFκB, PPARγ, RXR y PGC1α aumentaron en células infectadas con rotavirus RRV y en células transfectadas con plásmidos que expresan para cada una de las NSPs se observó que la expresión de p-IKKα/β aumento en presencia de NSP3,4,5 y 6; NFκB aumento en presencia de NSP1, 3 y 4, p-NFκB aumento en presencia de NSP1, 2, 3, 4, 5 y 6; PPARγ aumento en presencia de NSP1, 3, 5 6; RXR aumentó en presencia de NSP4, 6 y PGC1α aumento en presencia de NSP1 y 5. Al analizar por ELISA la unión in-vitro con proteínas recombinantes se observó unión entre rPPARγ y rNSP 1, 2, 3, 4 y RXR con rNSP1; cuando se estudió la unión por ELISA in-vivo en células infectadas y/o transfectadas con cada uno de los plásmidos que expresan proteínas celulares con las proteínas virales, se evidenció unión entre PPARγ con NSP1, 2, 3, 4; RXR con NSP1,6; p-IKKα/β con NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5, NSP6 y p-NFκB con NSP 5, 6. Posteriormente, por microscopia confocal, se observó colocalización de RXR con NSP1; PPARγ con NSP1 y NSP3; p-IKKα/β con NSP2 y NFκB con NSP5. Finalmente, cuando se analizó si la infección por rotavirus RRV afecta la activación de la vía inflamatoria; se estudió la expresión de PPARγ a nivel citoplasmático y nuclear por Western blot, identificándose la presencia de p- PPARγ. Adicionalmente, por ELISA in-vivo en células, se evaluó la unión entre PPARγ y PGC1α, encontrándose que solo a nivel nuclear hay unión de estas dos proteínas celulares en células infectadas con rotavirus RRV y en células transfectadas con los plásmidos que expresan para NSP2 y 4. Además, al activar la vía PPARγ con un agonista como Tiazolinediona o inhibirla con un antagonista como GW-9662, tratando células infectadas o no y/o transfectadas con plásmidos que expresan para cada una de las proteínas NSPs, se observó que la expresión de PPARγ disminuía en células infectadas y tratadas con Tiazolinediona y aumentaba en células infectadas y tratadas con el inhibidor GW-9662, pero cuando las células eran transfectadas con plásmidos que expresan para cada una de las proteínas NSPs y tratadas con el inhibidor GW-9662 se observó aumento de la expresión de PPARγ en presencia de NSP1, 5 y 6. Por otra parte, cuando se inhibió la vía NFκB con un inhibidor como curcumina, se observó que la expresión de NFκB disminuía en células infectadas y tratadas con curcumina y en células transfectadas con plásmidos que expresan para cada una de las proteínas NSPs y tratadas con curcumina se observó disminución de la expresión de NFκB en presencia de NSP2 y 4. CONCLUSIÓN: Durante la infección por Rotavirus, la expresión de NFκB y su actividad transcripcional aumentan, se observa que RXR colocaliza con NSP1, PPARγ colocaliza con NSP1 y NSP3, p-IKKα/β colocaliza con NSP2 y NFκB colocaliza con NSP5. Adicionalmente, a nivel citoplasmático se detectó que a las 12 h.p.i. PPARγ está siendo fosforilado. Por otra parte, en el núcleo, PPARγ se encuentra unido a PGC1α, sin embargo, la actividad transcripcional disminuye. (Texto tomado de la fuente)

Rotavirus is a virus belonging to the family Reoviridae, icosahedral without envelope; Its capsid is made up of three layers: external, middle and internal. Measuring approximately 70nm in diameter, its 11-segment double-stranded RNA genome encodes six structural (VP) and six non-structural (NSP) proteins.

GENERAL OBJECTIVE: To determine the union of the non-structural Rotavirus proteins (NSP1-6) with proteins of the PPARγ-NFκB pathway.

METHODOLOGY: The expression of cellular proteins related to the NFκB and PPARγ pathways was evaluated, using ELISA, luminescence, flow cytometry and Western blot techniques, in MA104 cells infected with Rotavirus and / or transfected with each of the plasmids that express for NSPs proteins. The binding between cellular and viral proteins (NSPs) was examined by ELISA, Epi-fluorescence and confocal microscopy techniques.

RESULTS: The expression of the proteins p-IKKα / β, NFκB, p-NFκB, PPARγ, RXR and PGC1α increased in cells infected with rotavirus RRV and in cells transfected with plasmids expressing for each of the NSPs it was observed that the expression p-IKKα / β increase in the presence of NSP3,4,5 and 6; NFκB increased in the presence of NSP1, 3 and 4, p-NFκB increased in the presence of NSP1, 2, 3, 4, 5 and 6; PPARγ increased in the presence of NSP1, 3, 5 6; RXR increased in the presence of NSP4, 6 and PGC1α increased in the presence of NSP1 and 5. When analyzing in-vitro the binding in vitro with recombinant proteins, binding between rPPARγ and rNSP 1, 2, 3, 4 and RXR with rNSP1 was observed; When the binding by ELISA in-vivo was studied in cells infected and / or transfected with each one of the plasmids that express cellular proteins with the viral proteins, binding between PPARγ with NSP1, 2, 3, 4 was evident; RXR with NSP1,6; p-IKKα / β with NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5, NSP6 and p-NFκB with NSP 5, 6. Subsequently, by confocal microscopy, RXR colocalization with NSP1 was observed; PPARγ with NSP1 and NSP3; p-IKKα / β with NSP2 and NFκB with NSP5. Finally, when it was analyzed if the infection by rotavirus RRV affects the activation of the inflammatory pathway; The expression of PPARy at the cytoplasmic and nuclear level was studied by Western blot, identifying the presence of p-PPARy. Additionally, by in-vivo ELISA in cells, the binding between PPARγ and PGC1α was evaluated, finding that only at the nuclear level there is binding of these two cellular proteins in cells infected with rotavirus RRV and in cells transfected with the plasmids that express for NSP2 and 4. Furthermore, when activating the PPARγ pathway with an agonist such as Thiazolinedione or inhibiting it with an antagonist such as GW-9662, treating cells infected or not and / or transfected with plasmids that express for each of the NSPs proteins, it was observed that the expression PPARγ decreased in cells infected and treated with Thiazolinedione and increased in cells infected and treated with the GW-9662 inhibitor, but when the cells were transfected with plasmids that express for each of the NSPs proteins and treated with the GW-9662 inhibitor, observed an increase in PPARγ expression in the presence of NSP1, 5 and 6. On the other hand, when the NFκB pathway was inhibited with an inhibitor such as curcum ina, it was observed that the expression of NFκB decreased in cells infected and treated with curcumin and in cells transfected with plasmids that express for each of the NSPs proteins and treated with curcumin, a decrease in the expression of NFκB was observed in the presence of NSP2 and 4. CONCLUSION: During Rotavirus infection, the expression of NFκB and its transcriptional activity increase, it is observed that RXR collocates with NSP1, PPARγ collocates with NSP1 and NSP3, p-IKKα / β collocates with NSP2 and NFκB collocates with NSP5. Additionally, at the cytoplasmic level, it was detected that at 12 p.m. PPARγ is being phosphorylated. On the other hand, in the nucleus, PPARγ is bound to PGC1α, however, transcriptional activity decreases.