Aprovechamiento de lactosuero ácido para la obtención de péptidos bioactivos mediante tecnologías de concentración proteica e hidrólisis enzimática

Abstract

Las técnicas de concentración de proteínas y la hidrólisis enzimática han demostrado ser herramientas útiles para la obtención de péptidos bioactivos desde fuentes proteicas vegetales y animales generadas en los procesos agroindustriales; algunos de estos subproductos, como el lactosuero, son considerados contaminantes medio ambientales; por lo tanto, es necesaria la implementación de metodologías que permitan transitar de un modelo lineal de producción, basado en extraer, transformar y desgastar, a un modelo de producción circular donde prima la reducción, la reutilización y el reciclaje. Los procesos de concentración e hidrolisis proteica han sido aplicados ampliamente en el lactosuero dulce para la producción de una diversidad de productos; mientras que el uso del lactosuero ácido ha sido limitado debido a su alta salinidad y acidez. Por esta razón, el objetivo de este estudio fue obtener péptidos bioactivos a partir de proteínas de lactosuero ácido, aplicando tecnologías de concentración proteica e hidrolisis enzimática, y evaluar su estabilidad a la digestión in vitro.

En la primera fase (capítulo 2), se evaluaron tres métodos de concentración de proteínas a partir del lactosuero ácido líquido: precipitación térmica (PT), tratamiento con sales (TS) y ultrafiltración (UF); posteriormente, estos concentrados proteicos fueron sometidos a hidrólisis con tres proteasas diferentes (alcalasa, quimotripsina, flavourzima) para la obtención de hidrolizados con capacidad antioxidante in vitro, obtenidos bajo condiciones establecidas preliminarmente. A los hidrolizados se les determinó el contenido de proteína soluble, la concentración de aminoácidos libres, el grado de hidrólisis y la actividad antioxidante (método ABTS, poder reductor y actividad quelante de hierro). En los productos obtenidos por PT, TS y UF, el contenido de proteína fue de 53, 75 y 49% (p/p) y el porcentaje de rendimiento de 43, 28 y 46%, respectivamente. La actividad antioxidante de todos los concentrados mejoró después de 24 horas de hidrólisis con las diferentes enzimas. Mayor capacidad de captación del radical ABTS y actividad quelante de hierro fueron observadas en los concentrados PS y UF cuando fueron hidrolizados con alcalasa y quimotripsina, mientras el poder reductor fue superior en todos los hidrolizados obtenidos con flavourzima. Por lo tanto, el método de concentración podría influir en la conformación de la proteína y sus características funcionales. De acuerdo con los resultados, los concentrados TS y UF podrían ser utilizados en la preparación de hidrolizados antioxidantes. Sin embargo, cuando se utiliza TS deben ser aplicadas otras metodologías, como diálisis o UF, para remover las sales aplicadas durante el tratamiento. Adicionalmente, la UF es una tecnología que está al alcance de la industria láctea y podría ser implementada a escala industrial. Por consiguiente, en la segunda fase de esta investigación se utilizó el método de UF para la recuperación y concentración de proteínas de lactosuero.

En la segunda fase (capítulo 3), se optimizaron las condiciones de hidrólisis, relación enzima/sustrato (1/20-1/230, p/p) y tiempo (1–9 h), del concentrado de proteínas obtenido por ultrafiltración del lactosuero empleando la metodología de superficie de respuesta con un diseño central compuesto y se evaluaron las mismas variables mencionadas en la primera fase. La relación enzima-sustrato y el tiempo afectaron significativamente el contenido de proteína, aminoácidos libres, grado de hidrólisis y la actividad antioxidante. En general, al incrementar ambos parámetros hubo una disminución en la concentración de proteína y un aumento en el contenido de aminoácidos libres, grado de hidrólisis y actividad antioxidante. Las condiciones óptimas para obtener hidrolizados con mayor potencial antioxidante fueron una relación enzima-sustrato de 1/20 (p/p) para todas las enzimas y un tiempo de hidrólisis de 7, 2 y 6 h para alcalasa, quimotripsina y flavourzima, respectivamente. La actividad antioxidante de los hidrolizados obtenidos bajo condiciones óptimas por el método ABTS varió entre 80.32±1.03 y 224.72±5.09 µmol trolox/g, el poder reductor osciló entre 3.37±0.28 y 19.71±0.27 µmol trolox/g y se observó una capacidad quelante de hierro superior a 60%. Adicionalmente, los hidrolizados mostraron una capacidad inhibitoria de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) superior al 82%. Posteriormente, estos hidrolizados fueron fraccionados mediante cromatografía de intercambio iónico, y las fracciones activas biológicamente fueron analizadas por UHPLC-ESI-MS/MS para identificar posibles secuencias. Se identificaron 23 péptidos que contenían aminoácidos característicos de péptidos antioxidantes e inhibidores de la ECA.

En la etapa final (capítulo 3), se determinó el perfil de péptidos de los hidrolizados obtenidos bajo condiciones óptimas por UHPLC-ESI-MS/MS y se evaluó el efecto de la digestión gastrointestinal in vitro sobre el perfil de péptidos y las propiedades biológicas de los hidrolizados. Se identificaron 17, 24 y 14 posibles secuencias peptídicas de diferentes tamaños en los hidrolizados obtenidos con alcalasa, quimotripsina y flavourzima, respectivamente. Se obtuvieron principalmente péptidos de bajo peso molecular (3-4 aminoácidos) con alcalasa, y péptidos de tamaño mediano y grande (hasta 23 aminoácidos) con quimotripsina y flavourzima. Después de la digestión in vitro, la actividad antioxidante por el método ABTS incrementó, mientras que la capacidad inhibitoria de la ECA disminuyó en los hidrolizados de alcalasa y quimotripsina. No se evidenciaron cambios significativos en las propiedades biológicas del hidrolizado de flavourzima. 35, 79 y 71% de los fragmentos peptídicos identificados en los hidrolizados de alcalasa, quimotripsina y flavourzima, respectivamente, fueron degradados durante la digestión in vitro.

En general, los resultados presentados en este trabajo constituyen un avance significativo del conocimiento sobre estrategias que permitan aprovechar el lactosuero ácido, un co-producto en la elaboración de queso doble crema que es subutilizado, para la obtención de proteínas de lactosuero y su empleo como fuente de péptidos bioactivos empleando métodos de separación y concentración proteica e hidrólisis enzimática. Particularmente, se obtuvieron hidrolizados de proteína de lactosuero ácido que exhibieron bio-funcionalidad en ensayos in vitro como actividad antioxidante y capacidad inhibitoria de la ECA, las cuales fueron afectadas por las variables de proceso y la especificidad de las enzimas. Adicionalmente, se determinó el perfil de péptidos en los hidrolizados y su estabilidad a la digestión in vitro mostrando que los fragmentos peptídicos INY, IRL, VLDTDY, IIAE, SFNPT, GGVSLPE y TPEV resistieron este proceso y potencialmente pueden exhibir propiedades antioxidantes o inhibitoria de la ECA.

Techniques for the protein concentration and enzymatic hydrolysis have shown to be useful tools for obtaining bioactive peptides from plant and animal protein sources generated in agro-industrial processes. Some of these by-products, such as whey, are considered environmental pollutants; therefore, the implementation of methodologies that allow the transition from a linear production model, based on extracting, transforming and disposing, to a circular production model where reduction, reuse and recycling take precedence, is necessary. Protein concentration and hydrolysis processes have been widely applied in sweet whey for the production of a variety of products, while the use of acid whey has been limited due to its high salinity and acidity. For this reason, the objective of this work was to obtain bioactive peptides from acid whey proteins, applying technologies of protein concentration and enzymatic hydrolysis, and to evaluate their stability to in vitro digestion.

In the first stage (Chapter 2), three methods of protein concentration from liquid acid whey were evaluated: thermal precipitation (TP), salt treatment (ST) and ultrafiltration (UF); subsequently, these protein concentrates were subjected to hydrolysis with three different proteases (alcalase, chymotrypsin, flavourzyme) to obtain hydrolyzates with in vitro antioxidant capacity, obtained under previously established conditions. The soluble protein content, free amino acid concentration, degree of hydrolysis and antioxidant activity (ABTS assay, reducing power and iron-chelating activity) of each hydrolysates were determined. The protein content of the concentrates was 53, 75 and 49% (w/w) y a yield percentage of 43, 28 and 46%, in the products obtained by TP, ST and UF, respectively. Antioxidant activity of all concentrates improved with the different enzymes after 24 hours of hydrolysis. Greater ABTS radical scavenging and iron-chelating activities were observed in the ST and UF concentrates when hydrolyzed with alcalase and chymotrypsin, while reducing power was higher in all the hydrolysates obtained with flavourzyme. Therefore, the method of concentration could influence on protein conformation and its functional characteristics. According to the results, the ST and UF concentrates could be used in the production of antioxidant hydrolysates. However, other methodologies, such as dialysis or UF, must be applied when ST is used to remove salts applied during the treatment. Additionally, UF is an available technology at the dairy industry and could be implemented on an industrial scale. Consequently, the UF method was used for the recovery and concentration of whey proteins in the second stage.

In the second stage (Chapter 3), the hydrolysis conditions, enzyme/substrate ratio (1/20-1/230, w/w) and time (1-9 h), of protein concentrate obtained by ultrafiltration of whey were optimized using response surface methodology with a central composite design. The variables mentioned in the first stage were also evaluated. The protein content, free amino acid concentration, degree of hydrolysis and antioxidant activity were significantly affected by enzyme/substrate ratio and time. In general, a decrease in protein concentration and an increase in amino acid content, degree of hydrolysis and antioxidant activity were detected when increasing both parameters. The optimal conditions were an enzyme/substrate ratio of 1/20 (w/w) for all enzymes and time of hydrolysis of 7, 2 and 6 h for alcalase, chymotrypsin and flavourzyme, respectively, for obtaining hydrolysates with maximum antioxidant potential. The antioxidant activity of the hydrolysates obtained under optimal conditions by the ABTS method varied between 80.32±1.03 and 224.72±5.09 µmol trolox/g, reducing power ranged from 3.37±0.28 to 19.71±0.27 µmol trolox/g, and iron-chelating capacity was greater than 60%. Additionally, hydrolysates showed an angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitory capacity superior to 82%. Subsequently, these hydrolysates were fractionated by ion exchange chromatography, and biologically active fractions were analyzed by UHPLC-ESI-MS/MS to identify possible sequences. 23 peptides were identified containing characteristic amino acids of antioxidant and ACE-inhibitory peptides.

In the final stage (Chapter 4), the peptide profile of the hydrolysates obtained under optimal conditions was determined by UHPLC-ESI-MS/MS, and the effect of in vitro gastrointestinal digestion on peptide profile and biological properties of the hydrolysates was evaluated. 17, 24 and 14 possible peptide sequences with different sizes were identified in the alcalase, chymotrypsin and flavourzyme hydrolysates, respectively. Low molecular weight peptides (3-4 amino acids) were mainly obtained with alcalase, and medium and long peptides (up to 23 amino acids) with chymotrypsin and flavourzyme. After in vitro digestion, antioxidant activity by the ABTS method increased, while ACE-inhibitory capacity decreased in the alcalase and chymotrypsin hydrolysates. There were no significant changes in biological properties of the flavourzyme hydrolysate. 35, 79 and 71% of the peptide fragments identified in the alcalase, chymotrypsin and flavourzyme hydrolysates, respectively, were degraded during in vitro digestion.

In general, the results presented in this work constitute a significant advancement of knowledge about strategies for the use of acid whey, a co-product obtained in the production of double-cream cheese that is underused, for obtaining whey proteins and their use as a source of bioactive peptides by methods of protein separation and concentration, and enzymatic hydrolysis. In particular, acid whey protein hydrolysates that exhibited bio-functionality, using in vitro assays, such as antioxidant and ACE-inhibitory activities were obtained, which were affected by process variables and enzyme specificity. Additionally, peptide profile in the hydrolysates and their stability to in vitro digestion were determined, showing that the peptide fragments INY, IRL, VLDTDY, IIAE, SFNPT, GGVSLPE and TPEV resisted this process and may potentially exhibit antioxidant or ECA-inhibitory properties.