Análisis de la unión del rotavirus a los glóbulos rojos y el efecto que tiene dicha unión en la capacidad infecciosa en líneas tumorales.

Abstract

Los virus oncolíticos (VO) son una alternativa prometedora para el tratamiento del cáncer. Estos virus se caracterizan por ser partículas no patógenas que infectan específicamente células cancerosas provocando su muerte, mientras que no afectan los tejidos sanos. El grupo de biología molecular de virus de la Universidad Nacional de Colombia ha realizado trabajos que evalúan la capacidad oncolitica del rotavirus. Inicialmente se seleccionaron 5 aislados de rotavirus, que fueron cultivados en líneas celulares tumorales. Estos virus presentaron un tropismo por células que expresaran las proteínas de choque térmico (HSP), la integrina αVβ3 y la proteína disulfuro isomerasa (PDI). Como las PDI o las HSPs (incluida Hsc70) no se expresan en la membrana de células del tejido normal y sí en neoplasias, se planteó la posibilidad de usar el rotavirus en tumores donde estos receptores se expresen. Siguiendo las recomendaciones de "The international conference on harmonisation of technical requirement for registration of pharmaceuticals for human use" (ICH) respecto al diseño y uso de agentes virales oncolíticos, se realizaron estudios en modelos in vitro para determinar las características replicativas diferenciales de los virus en tejido neoplásico. Para esto se usaron las líneas celulares de leucemia mieloide humana U937, leucemia linfocítica aguda REH, cancer de estómago KATO III, cáncer de pulmón A549, cáncer de mama MCF-7, mieloide de ratón Sp2/0-Ag14 y cultivos primarios de leucemias humanas. Como control se utilizaron células normales no tumorales. Se determinó si las células tumorales analizadas expresan HSPs y si los rotavirus utilizan estas moléculas celulares, junto con PDI y la integrina 3, durante el proceso infeccioso. En conclusión, los aislados de rotavirus obtenidos en nuestro laboratorio infectaron y lisaron las líneas celulares tumorales examinadas; el ingreso a la célula se realizó utilizando las HSPs (Hsp90, Hsp70, Hsc70, Hsp60 o Hsp40), PDI y la integrina αvβ3 de membrana citoplasmática, sugiriendo que han adquirido ganancia de función al utilizar proteínas de choque térmico (HSPs). Los virus oncolíticos pueden ser administrados vía intravenosa; sin embargo, se conoce que algunos rotavirus tienen la capacidad de aglutinar los glóbulos rojos (hemaglutinación). En caso de aplicarse los aislamientos rotavirales utilizados en este trabajo a animales o humanos, eso sería un inconveniente porque podrían desencadenar tromboembolismo, al menos teóricamente. Otro riesgo que se corre es el “secuestro” de los virus por las células del torrente sanguíneo, que impedirían su llegada al tumor. Por lo anterior, era indispensable determinar si los aislamientos rotavirales con actividad oncolítica presentaban hemaglutinación, si se unian a los glóbulos rojos y si dicha unión interfería con la infección a células tumorales. Para abordar el problema, se realizó el ensayo de hemoaglutinación, teniendo como referencia los virus patrón que dieron origen a los aislamientos y la proteína VP8 del rotavirus hemaglutinante RRV. Se encontró que los aislamientos rotavirales no tienen capacidad hemaglutinante aunque TRUY y WTEW presentaron ligera hemaglutinación con las mayores concentraciones. Este efecto habrá que tenerse en cuenta en los estudios in vivo para determinar si impiden su uso o no como virus oncolítico. En un segundo ensayo se encontró que los aislamientos se unen a los glóbulos rojos y que dicha unión no impide la infección a las células tumorales. Se evaluó posteriormente la infección de los virus incubados con las glicoproteínas solubles presentes en el suero fetal bovino (SFB), las membranas citoplasmáticas de los glóbulos rojos o la glicoproteína mayoritaria en los glóbulos rojos, la glicoforina; esta unión tampoco impidió la infección a las células tumorales. Especulamos que la afinidad de los rotavirus por los receptores celulares en las células tumorales es mayor que la presentada por en la unión a los glóbulos rojos.

Abstract: Ontolytic viruses (OV) emerge as a promising alternative for the treatment of cancer. These viruses are characterized by being non pathogenic particles that specifically infect cancerous cells causing their death, not affecting healthy tissues. The group of molecular biology of viruses of the National University of Colombia has made some work to assess the oncolytic capacity of the rotavirus. Initially, 5 isolates of the rotavirus were selected and cultured on tumor cellular lines, these viruses presented a tropism by cells that will express the Heat Shock Proteins (HSP), the integrin αVβ3 and the protein disulfide isomerase PDI. As PDI or HSPs, including Hsc70, are not expressed in the membrane of the cells of normal tissue, as they do in the neoplasm; there was the suggestion of the possibility to use the rotavirus in tumors where these receptors would express themselves. Following the recommendation of "The international conference on harmonization of technical requirement for registration of pharmaceuticals for human use", (ICH) in relation to the design and use of viral ontolytic agents, studies on in vitro models were carried out to define the differential replicative characteristics of the viruses in neoplastic tissue. For this, cellular lines of myeloid leukemia U937, acute lymphoblastic leukemia REH, stomach cancer KATO III, lung cancer A549, breast cancer MCF-7, mouse myeloid Sp 2/0- Ag14 and primary cultures of human leukemia were used. Non- tumor normal cells were used as regulators. It was determined if the analyzed tumor cells express HSPs and if the rotavirus uses these cellular molecules, with PDI and the 3 integrin, during the infectious process. In conclusion, the isolates of rotavirus obtained in our laboratory infected and lysed the examined tumor cellular lines; the entry to the cell was made using the HSPs (Hsp90, Hsp70, Hsc70, Hsp60 o Hsp40), PDI and the integrin of cytoplasmic membrane, suggesting they have acquired gain of function by using Heat Shock Proteins (HSPs). Ontolytic viruses can be administered by intravenous way, however it’s known that some rotavirus have the ability to agglutinate red blood cells (hemagglutination). In case of applying the rotaviral isolates used in this work to animals or humans could be an inconvenient because they could trigger a thromboembolism, theoretically at least. Another risk is the ‘sequestration’ of viruses by bloodstream cells that would block their arrival to the tumor. For these reasons, it was essential to determine if the rotaviral isolates, with oncolytic activity, presented hemagglutination if they join to the red blood cells and if that union interfered with the infection of tumor cells. To approach to the problem a test of hemagglutination was carried out, having as reference the pattern viruses that gave origin to the isolates and the VP8 protein of the hemagglutinating virus RRV. It was found that the rotaviral isolates don’t have the hemagglutinating capacity in its basics, though TRUY and WTEW presented a slight hemagglutination with higher concentrations. This effect will have to be taken into account in the in vivo studies to determine if they blocked their use or not, as an ontolytic virus. In the second test it was found that the isolates bind to the red blood cells and that this binding doesn´t block the infection to the tumor cells. Later, there was an evaluation on the infection of incubated viruses with the soluble glycoprotein present in the bovine fetal serum (BFS), the cytoplasmatic membranes of the red blood cells or the major glycoprotein in the red blood cells, the glycophorin; this bind didn’t either prevent the infection of the tumor cells. We speculate that the affinity of the rotaviruses by the cellular receptors is higher than the one presented by the sugars of the red blood cells.