Estudio molecular y bioquímico de un candidato a sirtuina en Giardia duodenalis

Abstract

Las sirtuinas son una familia de proteínas muy conservada y ampliamente distribuida a lo largo de todos los dominios de la vida. Estas proteínas se encuentran agrupadas en la clase III de las deacetilasas de histonas, la cuales tienen como característica especial su dependencia de NAD+ como cosustrato para llevar a cabo la deacetilación de residuos de lisina, en proteínas histónicas y no histónicas, tales como las histonas H3, H4 así como el factor de trascripción p53. El requerimiento de NAD+ para la actividad sirtuina, convierte a este grupo de proteínas en sensores metabólicos, que se ven favorecidos en periodos de estrés calórico. Actualmente, se conoce que estas proteínas se encuentran involucradas en procesos celulares fundamentales, para el correcto funcionamiento celular. A pesar del importante rol de las sirtuinas para la función celular, el papel que cumplen estas proteínas en parásitos protozoarios es a la fecha un campo muy poco explorado, salvo por algunas sirtuinas de Plasmodium, Trypanosoma y Leishmania. En este trabajo se realizó la caracterización bioinformática y experimental de los candidatos a sirtuina GdSir2.1 y GdSir2.2 presentes en el genoma de Giardia duodenalis, para ello se realizó: la clonación, expresión en E. coli, purificación de las proteínas recombinantes, evaluación de su capacidad de deacetilación in vitro, y, por último, ensayos inmunológicos y de retrotranscripción, para determinar la localización subcelular y expresión de estas proteínas. Esto permitió identificar en las estructuras primarias y terciarias predichas de estos candidatos, características estructurales conservadas para la familia sirtuina, como los son: el dominio con plegamiento tipo Rossmann de unión a NAD+ y el domino de unión a zinc. La aproximación experimental permitió a nivel in vitro la expresión de las proteínas recombinantes Hisx6-GdSir2.1, Hisx6-GdSir2.2 y MBP-GdSir2.2, junto con la determinación la capacidad deacetilasa dependiente de NAD+ del candidato GdSir2.1. Los ensayos in vivo, por su parte, permitieron identificar que estos genes son transcripcional y traduccionalmente activos en trofozoítos del parásito. El desarrollo de anticuerpos policlonales aviares y murinos contra las proteínas recombinantes, permitió determinar una localización citoplasmática y nuclear para GdSir2.1 y GdSir2.2 respectivamente en trofozoítos. El análisis de la expresión a nivel proteico de la proteína endógena GdSir2.2 durante la enquistación, mostró que la proteína disminuye su expresión a las 24 h postinducción de este proceso.

Abstract: The sirtuins are a family of proteins pretty conserved and widely distributed across all domains of life. Those proteins are grouped within the histone deacetylases-class III, which are distinctly characterized by their NAD+-dependence to carry out their deacetylation activity over lysine residues of histone proteins and non-histone proteins such as the histones H3 and H4 as well as the transcriptional factor p53. The dependence upon NAD+ for sirtuin activity makes this group of proteins metabolic sensors that are favored during times of caloric stress. Currently, it is known that these proteins are involved in metabolic processes fundamental for the correct function of cells. Despite the important role of sirtuins for cellular function, the role of these proteins in protozoan parasites is at the moment a field poorly explored, except for some proteins of Plasmodium, Trypanosoma and Leishmania. In this study, the bioinformatic and experimental characterizations of the sirtuin-candidates GdSir2.1 and GdSir2.2 present in Giardia duodenalis genome was carried out. To do this, cloning, expression in E. Coli, purification of the recombinant proteins and evaluations of their capacity for deacetylation in vitro were performed. Finally, immunological and retrotranscriptional assays to identify the subcelular localization, protein and gene expressions of those candidates were done. This allowed the identification in the primary and predicted-tertiary structures of these candidates, conserved structural features in the sirtuin family, such as the Rossmann folds domain for NAD+ binding and the zinc-binding domain. The experimental approach allowed at in vitro level the expression of the recombinant proteins Hisx6-GdSir2.1, Hisx6-GdSir2.2 y MBP-GdSir2.2 as well as the determination of the NAD+-dependent deacetylase capacity of GdSir2.1 candidate. For their part, the in vivo assays allowed to identify that these genes are transcriptionally and traductionally active in Giardia trophozoites. The avian and murine polyclonal antibodies development against the recombinant proteins allowed determining cytoplasmic and nuclear localizations for GdSir2.1 and GdSir2.2 in trophozoites respectively. The analysis of protein-level expression for the endogenous GdSir2.1 throughout the encystation showed that the protein decrease its expression at 24 hours post induction of this process.