Evaluación de efectos antitumorales de un oligonucleótido (ODN) tipo señuelo dirigido a STAT3 en un modelo de línea celular de cáncer de pulmón

Abstract

Resumen: Actualmente el cáncer continúa siendo una enfermedad con altas tasas de incidencia y mortalidad a nivel mundial. El desarrollo de nuevas moléculas para tratar los diferentes tipos de cáncer se encuentra enfocado en la terapia molecular dirigida. Sin embargo, pocas estrategias de este tipo han alcanzado la etapa de estudios clínicos debido a sus efectos inespecíficos, inestabilidad o baja permeabilidad celular. Los oligonucleótidos (ODNs) tipo señuelo son una alternativa para la terapia molecular dirigida. Estos han mostrado gran efectividad en diversos modelos de líneas celulares, junto con una mejor selectividad y mayor especificidad en sus efectos. Se seleccionó al factor de transcripción STAT3 como un blanco molecular potencial ya que su sobrexpresión en el tejido tumoral claramente se ha asociado con el desarrollo y progresión del cáncer de pulmón y a fenómenos de resistencia a medicamentos usados en clínica. El objetivo de este trabajo fue validar el potencial antitumoral de ODNs dirigidos contra STAT3 en líneas celulares de cáncer de pulmón teniendo en cuenta la selectividad y especificidad de los efectos. La expresión y activación de STAT3 fue medida por inmunofluorescencia para asegurar la presencia del blanco molecular en el modelo escogido. Posteriormente se cuantificó la captación celular de los ODNs por medio de citometría de flujo. Los efectos citotóxicos de los ODNs fueron determinados medio del ensayo metabólico de resazurina teniendo en cuenta diferentes concentraciones y tiempos de tratamientos. Finalmente se evaluó el posible mecanismo de muerte celular asociado a los tratamientos por medio de ensayos de actividad de caspasas y fragmentación nuclear por microscopía de fluorescencia. Los resultados mostraron que hubo una mayor expresión y activación del factor de transcripción STAT3 en las líneas tumorales respecto a una línea control de fibroblastos pulmonares. Además se encontró que los ODNs empleados fueron transfectados eficientemente en las células localizándose principalmente en el citoplasma. Mediante los ensayos de citotoxicidad se evidenció que los ODNs parental y modificado lograron la disminución de la supervivencia celular de forma dosis y tiempo dependiente alcanzando concentraciones letales 50 (CL50) en el rango nanomolar. Dichos efectos fueron exclusivos para las líneas tumorales y no para la línea celular normal demostrando la selectividad de los ODNs. Por otra parte se encontró que los ODNs bajo las condiciones de tratamiento indujeron un proceso de muerte por apoptosis y generaron cambios en la expresión de mRNA de tres genes blanco de STAT3. Estos resultados permitieron validar la tecnología de ODNs tipo señuelo como un modelo potencial de terapia dirigida con efectos selectivos sobre líneas celulares de cáncer de pulmón.

Abstract. Currently, the cancer is still a disease with high mortality and incidence rates. The development of new molecules to treat the different cancer types is focused on targeted therapy. However, very few strategies have reached the stage of clinical trials due to their non-specific effects, instability or low cell uptake. Decoys oligonucleotides (ODNs) are an alternative for molecular targeted therapy and have shown high effectiveness in many cell lines with selectivity and specificity in their effects. We choose the STAT3 transcription factor as a potential molecular target since its overexpression in tumor tissue has been associated with development and progression of lung cancer and drug resistance in clinical practice. The aim of this research was to validate the antitumor potential of ODNs targeting STAT3 in lung cancer cell lines taking into consideration selective and specific effects. Protein expression and activation of STAT3 was measured by immunofluorescence to ensure the presence of the molecular target in the chosen model. Subsequently the cellular uptake of ODNs was quantified by flow cytometry. The cytotoxic effects of ODNs were determined using the resazurin metabolic assay, taking into account different concentrations and treatment times. Finally, the probable mechanism of cell death associated with the treatments was evaluated by caspase activity assays and nuclear fragmentation by fluorescence microscopy. The results showed a greater expression and activation of STAT3 in the tumor lines compared to a control line of pulmonary fibroblasts. In addition, it was found that the ODNs employed were efficiently transfected into cells and located mainly in the cytoplasm. Cytotoxicity assays revealed that the parental and modified ODNs achieved a decrease in cell survival in a dose and time dependent manner reaching lethal concentrations 50 (CL50) in the nanomolar range. These effects were exclusive for tumor cell lines and not for a normal cell line showing the selectivity of the ODNs. On the other hand, it was found that the ODNs under the conditions of treatment induced a death process by apoptosis and generated changes in the mRNA expression of three STAT3 target genes. These results validated the decoy ODNs as a potential model of targeted therapy with selective effects on lung cancer cell lines.