Efecto de la inclusión de un forraje tanífero sobre las poblaciones metanogénicas del ecosistema ruminal en condiciones in vitro e in vivo

Abstract

La producción de metano en rumiantes está estrechamente ligada a la composición de los forrajes y metabolitos secundarios como taninos, mostrando efectos directos e indirectos sobre las poblaciones microbianas del rumen. El impacto de leguminosas taníferas sobre las poblaciones metanogénicas en condiciones del trópico de altura en Colombia, es desconocida a la fecha. Por lo anterior, este estudio buscó evaluar el efecto de la inclusión de la leguminosa tanífera Lotus uliginosus (Lotus) sobre la dinámica, diversidad y estructura de la población metanogénica en condiciones in vitro e in vivo. La técnica de producción de gas in vitro fue usada para evaluar la dinámica de las poblaciones metanogénicas durante las horas 0, 2, 4, 8, 12, 24 y 48, en respuesta a los taninos condensados del Lotus en dos experimentos, uno con diferentes proporciones de Lotus como forraje completo (0, 20, 40, 60 100%) y otro con niveles de inclusión del extracto de sus taninos condensados (0, 20, 40, 60 ppm), usando Pennisetum clandestinum (Kikuyo) como sustrato en ambos ensayos. Simultáneamente fue evaluada la dinámica de producción de metano por cromatografía de gases (CG) y la cantidad de metanógenos por qPCR usando el gen mrcA (metil coenzima-M reductasa). En una segunda fase del estudio se realizó el perfil electroforético de los metanógenos en el rumen de vacas no lactantes pastoreando en praderas compuestas por Kikuyo, la leguminosa Lotus y su asociación, usando la técnica de electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (PCR-DGGE, por sus en inglés) amplificando la región hipervariable V3 y cuantificando la abundancia de estas poblaciones por qPCR. Finalmente, se monitoreó la estructura y diversidad de la comunidad de metanógenos en el rumen de vacas lactantes sobre la misma pradera, usando la técnica de pirosecuenciación con la plataforma 454-GS FLX Titanium, para estimar la diversidad con los índices Chao1, índice de Simpson (1-D) y Shanon-Weimer (H´). La abundancia in vitro de metanógenos expresados como Log10 ng ADN/g MS fue significativamente afectada (P0,001) por los taninos en solución y asociadas al forraje, mientras la producción de gas y metano solamente disminuyó con los taninos asociados al forraje en un 61 y 86%, respectivamente. En vacas no lactantes, los perfiles electroforéticos formaron agrupamientos con similitud del 98, 94 y 96% para Kikuyo, la asociación y Lotus respectivamente. Un incremento en la abundancia de la población en praderas asociadas se evidenció en este ensayo (P0.001), mientras en vacas lactantes, la cantidad de metanógenos no cambió en función de la dieta (P=0.8051). En la estructura de comunidad en el rumen de vacas lactantes se identificaron los géneros dominantes Methanobrevibacter, Euryarchaeotas Sin Clasificar, Methanosphaera en proporciones de 72, 24 y 3%, respectivamente. Los índices de diversidad no fueron estadísticamente diferentes entre dietas, mostrando una baja diversidad para Simpson (0.5) y menor probabilidad de encontrar más especies cuando se incluyó Lotus (H’0). En conclusión, este trabajo demostró efectos variables sobre la abundancia, estructura y diversidad de la comunidad de metanógenos del rumen incluyendo Lotus y sus taninos condensados, indicando la importancia de la dieta como factor determinante en la respuesta de las comunidades del rumen.

Abstract. Methane production in ruminants is closely linked to the composition of the feed and secondary metabolites such as condensed tannins (CT), showing effects on rumen microbial populations. The impact of condensed tannin-containing forages on methanogenic populations under high tropical conditions in Colombia is unknown. The objective of the present work was to evaluate the effect of the inclusion of the tanniferous legume Lotus uliginosus (Lotus) on the dynamics, diversity and methanogenic population structure in vitro and in vivo. In vitro gas production was used for evaluating the dynamics of the methanogenic population at times 0, 2, 4, 8, 12, 24 and 48. Response to Lotus TC was analysed in two experiments, using Pennisetum clandestinum (Kikuyo) as basal substrate: one with different proportions of tanniferous legume (0, 20, 40, 60, and 100%) and other with diverse inclusion levels of CT extract (0, 20, 40, 60 ppm). Dynamics of methane production was evaluated by gas chromatography (GC) and methanogen numbers by quantitative real time qPCR, using the gene mrcA (methyl coenzyme M reductase). In a second phase of the study, molecular profiling of rumen methanogens was performed in non-lactating dairy cows, grazing in pastures composed by Kikuyu, Lotus or their combination. PCR denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) was employed to amplify the V3 hypervariable region and qPCR was used to quantify the abundance of these populations. Finally, the structure and diversity of the rumen methanogen community of lactating dairy cows grazing the same pasture, was monitored using the pyrosequencing platform 454-GS FLX Titanium; hence, diversity was estimated using the Chao1, Simpson (1-D) and Shannon-Weimer (H ') indices. In vitro methanogen abundance expressed as Log10 DNA ng / g MS was significantly affected (P 0.001) by tannins in solution and mixed with forage, while the production of total gas and methane only decreased when forage levels were 61 and 86%, respectively. In non-lactating dairy cows, the electrophoretic profiles formed clusters with similarity of 98, 94 and 96% for Kikuyu, Kikuyu: Lotus mix and Lotus, respectively. An increase in abundance in mixed pastures evidenced in this trial (P 0.001), whereas in lactating dairy cows, the amount of methanogens did not change as a function of diet (P = 0.8051). In the community structure in the rumen of lactating dairy cows dominant genera identified were: Methanobrevibacter, Rumen Cluster C, Methanosphaera in proportions of 72, 24 and 3%, respectively. Diversity indices were not statistically different between diets. Simpson index showed a low diversity (0.5) and lower probability of species detection when Lotus was included, compared with the Shannon-Wiener index (H ' 0). These results indicate the importance of diet in the dynamics of ruminal microbial communities. However, additional factors may impact the rumen methanogens and methane emissions. In conclusion, this work demonstrated variable effects on the abundance, structure and diversity of rumen methanogens community when including the Condensed Tannin-Containing Forage Lotus and its condensed tannins.