Modelamiento del sistema inmune aviar para la optimización de la producción de anticuerpos específicos

Abstract

Esta tesis presenta una metodología para optimizar la producción de anticuerpos específicos en aves. Anticuerpos (también conocidos como inmunoglobulinas) son herramientas biotecnológicas de gran valor usadas en investigación, diagnóstico y tratamiento. Usualmente, la producción de anticuerpos se realiza por medio de la inoculación en varias oportunidades de un animal con una concentración particular de un antígeno y la recolección de estas moléculas en las respuestas secundarias (cuando se producen grandes cantidades de estas proteínas). Frecuentemente, se usan mamíferos para producir anticuerpos a partir de la sangre de estos animales. Recientemente, la producción de inmunoglobulinas utilizando aves de corral ha generado mayor interés debido a que es posible obtener mayores concentraciones de estas moléculas que aquellas que se producen utilizando mamíferos. Adicionalmente, los anticuerpos aviares se pueden extraer de la yema de los huevos evitando la etapa de desangrado necesaria para obtener anticuerpos en otros animales. Sin embargo, hasta donde llega nuestro conocimiento los esquemas de inoculaci´on son completamente empíricos. Esto significa que los días seleccionados para administrar los refuerzos se escogen basados únicamente en la experiencia. Desde nuestro punto de vista, el diseño de un cronograma de inoculación óptimo se puede enfrentar como un problema de ingeniería, en el cual el sistema inmune del ave es un sistema dinámico que se puede modelar y las inoculaciones son señales extrínsecas que se pueden manipular. En conclusión, este documento describe el diseño de una metodología que maximiza la producción de anticuerpos espeíficos en aves. Esta metodología se basa en un modelo matemático que permite definir un problema de optimización que selecciona los días de aplicación de los refuerzos. En la primera etapa del proyecto, se construyó el modelo matemático que representa la dinámica de la respuesta inmune humoral en aves. Este modelo está compuesto por seis ecuaciones diferenciales ordinarias que consideran las principales poblaciones de la respuesta adaptativa: antígeno, células presentadoras de antígeno, linfocitos T y B, células B de memoria e inmunoglobulinas. Estas poblaciones y sus interacciones describen la dinámica de los procesos de presentación de antígeno, expansión clonal y memoria inmunológica. El modelo matemático incluye además 28 parámetros. Los valores de estos parámetros fueron obtenidos de la literatura especializada en inmunología en mamíferos y aves. No obstante, algunos de ellos no han sido reportados y por tanto se recurrió a la simulación para obtener un valor adecuado. Posteriormente, el comportamiento cualitativo del modelo fue analizado y se estableció que las repuestas inmunes simuladas eran similares a las respuestas experimentales reportadas en la literatura. Finalmente, se caracterizó el efecto sobre las poblaciones del modelo de variaciones en los valores de los parámetros a través de un análisis de sensibilidad. Estos resultados mostraron que las poblaciones tienen bajas sensibilidades a algunos de los parámetros propuestos mediante simulación. Simultáneamente al diseñoo del modelo, se realizaron algunos experimentos in vivo para caracterizar la respuesta inmune de un grupo de gallinas. Se midieron las poblaciones de linfocitos T y B as´ı como las concentraciones de anticuerpos en plasma y yema. La concentración de inmunoglobulinas se midió en miligramos por mililitro, en lugar del título. Tres grupos experimentales se emplearon, cada uno compuesto de cuatro gallinas, para evaluar la cinética de la respuesta humoral y cuantificar la producción total inmunoglobulinas isotipo Y. El primer grupo fue de control, mientras que el segundo y tercero fueron inoculados con dos concentraciones diferentes del antígeno: extracto prot´eico de Leishmania infantum. En este ensayo, se utilizó un esquema empírico para la aplicación de los refuerzos. Por tanto, la segunda inmunización se aplicó un mes después de la primera esperando generar una respuesta secundaria. Otras características de la respuesta inmune fueron determinadas durante esta etapa. Por ejemplo, se cuantificó la relación entre las respuestas en plasma y yema. Asimismo, se detectaron los niveles preinmunes y se compararon con los picos de la respuesta secundaria. Los resultados de esta parte del proyecto permitieron validar algunas de las suposiciones usadas en el modelo. En la tercera fase de esta tesis, las mediciones de anticuerpos se utilizaron para sintonizar algunos par´ametros del modelo buscando reproducir la respuesta de los grupos experimentales. Sin embargo, fue necesario definir primero algunas condiciones del proceso de estimación de parámetros. En particular, se requirió de una cuidadosa selección de los parámetros incluidos en la estimación debido a que el tamaño del conjunto de datos es menor que el número total de parámetros del modelo. Finalmente, se seleccionaron cinco parámetros utilizando un esquema de tipo Monte Carlo. Este proceso consistió en seleccionar aleatoriamente un subconjunto de cinco, realizar la estimación y cuantificar el error de ajuste. Los parámetros que produjeron los menores errores se seleccionaron. Usualmente, el procedimiento de estimación de parámetros se define como un problema de optimización, en este caso un problema de mínimos cuadrados. Para solucionar este tipo de problema, se emplean varios algoritmos de optimización. En nuestro caso, evaluamos el desempeño de cuatro. Estos algoritmos se basan en diferentes estrategias: dos de ellos usan información de gradientes y hessianas, otro pertenece a las técnicas conocidas como de búsqueda directa y el último es un algoritmo heurístico. El modelo representó adecuadamente los datos experimentales cuando la estimación se realizaba utilizando el algoritmo simplex Nelder-Mead. En una prueba adicional, la estimación de parámetros se realizó usando los datos menos el nivel preinmune y nuevamente el ajuste fue exitoso. La sensibilidad del algoritmo a los valores in´ıciales de los parámetros se determinó por medio de la realización de simulaciones masivas con variaciones de hasta }50%. La distribuci´on de frecuencias de los valores estimados mostró que los resultados se localizaban alrededor del valor nominal a pesar del cambo considerable en los valores iniciales. En la última parte de esta tesis, se utilizaron los modelos sintonizados con los datos experimentales para analizar el efecto de la variación en el día de la inoculación en la producción de anticuerpos. El primer conjunto de experimentos fue para el caso de un solo refuerzo y se realizó evaluando todas las posibles combinaciones por medio de simulaciones masivas. El tiempo mínimo requerido entre inmunizaciones que produce una respuesta secundaria se determinó para los modelos sintonizados con los datos de los dos grupos experimentales. Estas simulaciones sugirieron que es posible obtener una respuesta secundaria en un tiempo más corto que el propuesto empíricamente. Otro índice de desempeño utilizado fue la concentración total de inmunoglobulinas producida en un intervalo de tiempo definido. La robustez de la solución se caracterizó calculando el d´ıa ´optimo para el modelo sintonizado en todos los valores de los parámetros hallados en el análisis de sensibilidad de la etapa de estimación de parámetros. Adicionalmente, se evaluó el efecto de variar los valores de cada parámetro del modelo hasta en un 40%. Estos resultados mostraron que se obtuvieron variaciones significativas cuando se modificaban los valores de los parámetros relacionados con la memoria inmunológica. Sin embargo, estos valores producían respuestas muy retardadas en el tiempo que no correspondían a las observaciones experimentales. La selección de los días de inoculación que maximizan la producci´on de anticuerpos se puede definir como un problema de optimización binaria con restricciones. Para cualquier número finito de inoculaciones este problema se pude resolver usando un algoritmo genético. Por tanto, se utilizó esta estrategia para analizar el caso de dos refuerzos. Una vez más, los modelos sintonizados con los datos de los grupos experimentales fueron utilizados para definir los cronogramas de inoculaci´on. Posteriormente, se llevaron a cabo los mismos análisis con dos y cuatro refuerzos. Finalmente, usando experimentación in vivo se corroboraron las predicciones del modelo. Se inmunizó un grupo de gallinas siguiendo el esquema diseñado para un refuerzo. Para este experimento, se midió la concentración de inmunoglobulinas en yema y se encontró una respuesta secundaria con una reducción del 35% en el tiempo utilizado para aplicar el refuerzo. Este tiempo representa una reducción significativa en los costos asociados con el mantenimiento de las aves mejorando el proceso de producción de anticuerpos. / Abstract. This thesis presents a methodology to optimize specific antibody production in poultry. Antibodies (also known as immunoglobulins) are very valuable biotechnological tools used in research, diagnosis and treatment. Usually, antibody production consist of inoculating an animal with a particular concentration of an antigen several times and collecting antibodies in secondary responses (when greater amounts of these proteins are produced). Mammals are frequently used for producing immunoglobulins that can be obtained from animal’s blood. Recently, immunoglobulin production based on poultry has gained more attention, since it is possible to obtain larger amounts of these molecules than those generated using mammals. In addition, avian antibodies can be extracted from the egg’s yolk avoiding the bleeding stage used for other animal models. However, to the best of the authors’ knowledge the inoculation schedules are completely empirical. It means that days selected for administering boosters are chosen only based on experience. From our point of view, an optimal design of an inoculation timetable can be tackled as an engineering problem, in which the avian immune system is a dynamical system that can be modeled and inoculations are extrinsic signals that can be manipulated. Consequently, this document describes the design of a methodology to maximize specific antibody production in birds. It is based on a mathematical model that allows to define an optimization problem for selecting days to administer antigen boosters. In the first stage of the project, a mathematical model was built to represent the dynamics of the humoral response of birds. This model is comprised of six ordinary differential equations that account for the main populations of the adaptive response: antigen, antigen presenting cells, T and B lymphocytes, memory B cells and immunoglobulins. These populations and their interactions describe the dynamics of antigen presentation, clonal expansion and immunological memory processes. The mathematical model also includes 28 parameters. The values of these parameters were obtained from the specialized literature in mammalian and avian immunology. However, some of them have not been reported and adequate numerical values had to be found through simulation. Subsequently, the qualitative behavior of the model was analyzed and it was established that simulated immune responses to antigen inoculation were similar to experimental responses, reported in the literature. Finally, a sensitivity analysis showed the effect of varying parameter values on the populations of the model. These results showed that populations had low sensitivities to some of the values proposed by simulation. Simultaneously to the model design, in vivo experiments were performed to characterize the immune response of hens. T and B lymphocyte populations were quantified as well as antibody concentrations on plasma and yolk. The immunoglobulin concentration were measured in milligrams per milliliter, instead of the usual titer. Three experimental groups were utilized, each one composed of four hens, to test the kinetics of the humoral response and to quantify the total specific Y immunoglobulin production. The first group was a control one, while the second and third correspond to birds inoculated with two different concentrations of the proteinic extract of Leishmania infantum. In this assay, an empirical scheme for administering the inoculations was used. Therefore, the second immunization was applied about a month after the first one in order to generate a secondary response. Some other features of the immune response were also characterized during this stage. For instance, the relation between plasma and yolk responses was quantified in terms of proportionality and delay. Also, the preimmune levels were determined and compared to the secondary responses. Results of this part of the project allowed to validate some of the assumptions used in the model. In the third phase of the thesis, antibody measurements were used to tune some parameters of the model in order to reproduce the response of the experimental groups. However, some conditions of the parameter estimation process had to be established first. In particular, a careful selection of the parameters to be estimated was necessary, since the size of the data set was lower than the number of parameters included in the model. Using a Monte Carlo testing scheme, five parameters were selected for the parameter estimation. This process consisted in choosing randomly a subset of five parameters, then perform the estimation and quantify the error. Parameters that produced the lower errors were selected. Parameter estimation is usually set as an optimization problem, in this case a least squares problem. For solving this problem, several optimization algorithms can be employed. Therefore, the performance of four of them was explored. Those algorithms are based on different strategies: two of them use gradient and hessian information, another one belongs to the techniques known as direct search and the last one is a heuristic algorithm. Utilizing the simplex Nelder-Mead algorithm for solving the least squares problem, the model represented adequately the experimental data for the average response of each experimental group and also for two individual hens. In an additional test, the estimation process was also carried out for the observed data minus preimmune levels, and once again the adjustment was successful. The sensitivity of the algorithm to the initial guesses of the model’s parameters was determined through massive simulations varying those values by up to ±50%. The frequency distribution of the estimated values showed that paramteter estimates were clustered around the nominal value, despite significant changes in the initial guesses. In the last part of this thesis, the models obtained from experimental data were used to analyze the effect of varying the inoculation day on antibody production. The first set of experiments was for the case of a single booster and it was carried out evaluating all possible combinations by massive simulations. The minimum time required between immunizations to produce a secondary response was established for the models adjusted to the data of two experimental groups. These simulations suggested that it was possible to obtain a secondary response in a shorter time than that empirically proposed. As another performance index, the total immunoglobulin produced in an interval of time was employed to determine the optimal day to apply a booster. Results were very similar for both performance indexes (first secondary response and total antibody production) suggesting nearby days. The robustness of the solution was characterized by calculating the optimal day for the model tuned with all parameter values found in the sensitivity analysis of the parameter estimation algorithm. Also, the effect of varying the values of the parameters on the selected day was determined modifying up to 40% each parameter of the model and determining the first day that a secondary response occured. These results showed that larger variations were obtained when parameters related to the immunological memory changed significally. Nevertheless, those values produced