Evaluación del aislamiento Rotaviral TRUY como potencial agente oncolítico en células tumorales de ovario

Abstract

Durante las últimas décadas la terapia viral oncolítica ha sido reconocida como una nueva opción para el tratamiento del cáncer. Los virus oncolíticos (VO) son agentes terapéuticos que selectivamente pueden infectar, replicar e inducir muerte de la célula tumoral con mínimo impacto en la célula no tumoral. Este tropismo por células tumorales es dependiente de la expresión de receptores en la membrana, lo que le permite al virus la unión, la entrada y la replicación viral. Adicionalmente, los VO utilizan productos génicos virales que facilitan la evasión de la respuesta inmune, permiten el reconocimiento y penetración a la célula, e interactúan con la maquinaria celular para alterar los programas de muerte. Muchas de las vías celulares que los virus alteran son las mismas vías que se encuentran ya desreguladas en la célula tumoral y como consecuencia estas mismas vías son los blancos para el desarrollo de terapia antitumoral basada en virus. Los efectos antitumorales que se generan y las vías de señalización modificadas por el tratamiento con VO son dependientes de la especie del virus, las modificaciones genéticas del virus y el tipo de cáncer a tratar. Actualmente, muchos de los VO que se encuentran en ensayos clínicos tienen un tropismo natural para proteínas de superficie que son sobre expresadas en la célula tumoral o son modificados para que se unan directamente a un único receptor de la superficie celular. En el laboratorio de Biología Molecular del Virus de la Universidad Nacional de Colombia se ha venido trabajando en el estudio del potencial oncolítico de cinco rotavirus generados por evolución dirigida. Previamente, se demostró que estos virus utilizan las proteínas Hsc70, PDI e integrina αvβ3 como receptores en enterocitos y en líneas celulares tumorales y NO tumorales susceptibles. Uno de estos virus es el rotavirus TRUYO, el cual fue generado mediante pases continuos de cinco especies de rotavirus que infectan animales (TRF-cerdo, RRV-mono Rhesus, UK-bovino, YM-porcino y OSU porcino) en varias líneas celulares tumorales de origen humano que sobre expresan proteínas de choque térmico. En este trabajo se evaluó la capacidad oncolítica del rotavirus TRUYO en células de línea celular y cultivo primario obtenidos de tejido tumoral de pacientes con cáncer de ovario, determinando la importancia de las proteínas Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp40, PDI, Hsc70, β1 β2 y β3 durante el proceso infeccioso. Se encontró que el rotavirus TRUYO tiene la capacidad de infectar la línea celular MES-OV (ATCC), mediante el uso de las proteínas Hsp90, Hsp70, Hsc70, Hsp60, PDI e integrina β1 y β3. La entrada de este virus en las células MES-OV es mediada por endocitosis, posiblemente por macropinosoma. El ciclo de replicación encontrado fue de aproximadamente 8 horas y a las 12 h.p.i desencadena señales relacionadas con muerte por apoptosis. Las proteínas de muerte que se encontraron con mayor expresión fuero la caspasa 3 y caspasa 8. Así mismo, se logró establecer nueve cultivos primarios obtenidos de tejido tumoral de pacientes con cáncer de ovario, principalmente con fenotipo epitelial. Estas células fueron susceptibles y permisivas a la infección por rotavirus TRUYO. Se encontró heterogeneidad en el uso de las proteínas chaperonas, PDI e integrinas durante la entrada. Sin embargo, las proteínas que más con más frecuencia uso el virus para la entrada fueron la Hsp70, PDI, β1 y β3. Durante la infección en cultivo primario el virus indujo muerte celular mediante aumento en la permeabilidad de la membrana, exposición de la fosfatidilserina y aumento en la expresión de caspasa 3 fragmentada, Hsp60 y Hsp27. En conclusión, la susceptibilidad de las células tumorales de ovario a la infección por el rotavirus TRUYO dependen en parte por la presencia de las proteínas Hsps, PDI e integrina en la membrana celular, por lo cual se debe avanzar en la caracterización del potencial oncolítico del rotavirus TRUYO usando modelos in vivo de cáncer de ovario. Además, teniendo en cuenta los hallazgos en cuanto al uso de los receptores durante la entrada y el posible mecanismo por endocitosis, es importante evaluar cual es el mecanismo usado por el rotavirus TRUYO durante los primeros eventos de la infección. Dado la diversidad de interacción entre el rotavirus TRUYO y las proteínas de la membrana celular evaluadas en este trabajo se sugiere que no es necesario la presencia de todas las proteínas para que el virus entre a la célula, sino que es posible que estas proteínas compartan una misma característica, ya sea funcional o estructural.

In latest decades viral oncolytic therapy has been known as the novel cancer treatment. Oncolytic virus (OV) are therapeutic entities that can infect, replicate and induce death by lysis in tumoral cells with no relevant affection in normal cells. This tropism for tumoral cells is dependent on the receptor’s expression in the membrane that allows attachment, entry and viral replication. OVs also use genetic tools that allows them immune response evasion, cell’s recognition and internalization, that also allows it to interact with cell death machinery and disturbs it. Many of the routes that virus disturbs are the same that are already deregulated in tumoral cells, and therefore these routes are target for antitumoral therapy based on OVs. Antitumoral effects generated and signaling routes modified because of OV treatment are dependent of virus specie, genetic modifications and cancer type to treat. Nowadays, many of the OVs that are in clinic trials have a natural tropism for surface proteins already overexpressed in tumor cell or are modified to bounding to a specific receptor. Virus Molecular Biology laboratory of Universidad Nacional de Colombia has been working on oncolytic potential of five rotavirus generated with directed evolution. Previously, it has been shown that these viruses use Hsc70, PDI, and αvβ3 as receptors in enterocytes as well as in tumor and nontumoral susceptible cell lines. One of these viruses is TRUYO rotavirus, that it was generated with continuous passing of five animal infecting rotavirus (TRF-porcine, RRVmono Rhesus, UK-bovine, YM-porcine, and OSU-porcine) in different human tumor cell lines that were overexpressing heat shock proteins. In this job, it was evaluated its oncolytic ability in cell line and primary culture cells coming from tumoral tissue of patients with ovarian cancer, determining the importance of Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp40, PDI, Hsc70, β1 β2 and β3 proteins during infection process. It was found that TRUYO rotavirus has the ability of infecting MES-OV (ATCC) cell line, through Hsp90, Hsp70, Hsc70, Hsp60, PDI and integrins β1 y β3. Virus entry in MES-OV cells is endocytosis mediated possibly by macropynosome. Replication cycle was found to be Aprox. 8 hours, and at 12 h.p.i cells release apoptosis related signals. Caspase 3 and 8 (death proteins) were found with greater expression. Evaluación del aislamiento Rotaviral TRUY como potencial agente oncolítico en células tumorales de ovario 2019

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Likewise, it could be stablished primary culture of nine tumoral tissue of patients with ovarian cancer, primarily of epithelial phenotype. These cells were susceptible and permissive to TRUYO rotavirus infection. Heterogeneity use of chaperones proteins, PDI and integrins were found in virus entry. Nevertheless, Hsp70, PDI, β1 and β3 were the most frequent proteins in use. During primary culture infection, virus was capable of inducing death by means of membrane’s permeability, phosphatidylserine exposition and clivated caspase 3, Hsp60 and Hsp27 overexpression. In conclusion, susceptibility of ovarian tumoral cell to TRUYO infection depends on Hsps, PDI and integrins expression on cell membrane, so it will be needed to move on TRUYO rotavirus oncolytic potential characterization using ovarian cancer models in vivo. Also, having in mind the receptors used during virus entry and probably endocytosis mediated entry, it is important to evaluate the mechanism used during early infection events. Given the diversity interaction between rotavirus TRUYO and cell membrane’s proteins evaluated in this job it is suggested that the presence of all proteins is not needed for virus entry, but it is possible that these proteins share a same function or structure characteristic.