Identificación de proteínas diferencialmente expresadas candidatas a controlar la histocompatibilidad en el hidrozoario hydractinia symbiolongicarpus

Abstract

Los invertebrados coloniales y sésiles poseen la capacidad de distinguir entre los tejidos propios y aquellos de individuos no relacionados de su misma especie. Este fenómeno de alorreconocimiento se ha estudiado a profundidad en Hydractinia symbiolongicarpus, un hidrozoario que crece sobre las conchas de gastrópodos habitadas por los cangrejos ermitaños. Encuentros entre colonias de H. symbiolongicarpus son frecuentes y resultan en fusión, rechazo o fusión transitoria. Estudios con líneas endogámicas de H. symbiolongicarpus han demostrado que el alorreconocimiento es controlado por dos loci ligados, altamente polimórficos y con expresión codominante (alr1 y alr2), en donde colonias que comparten al menos un alelo de alguno de los dos loci se fusionan, mientras aquellas que no comparten alelos se rechazan. Alr1 y alr2 han sido clonados posicionalmente y codifican receptores de membrana con 2 o 3 dominios de inmunoglobulina. Si bien la variación de alr1 y alr2 predice los fenotipos de fusibilidad en las líneas endogámicas, en interacciones entre animales silvestres estas predicciones no se cumplen completamente. Esto sugiere que existen loci de alorreconocimiento adicionales que han sido homogenizados en las líneas endogámicas pero que pueden participar en el alorreconocimiento entre colonias silvestres. Con el objetivo de identificar potenciales alodeterminantes adicionales, en este trabajo se empleó una estrategia de proteómica comparativa usando colonias hermanas de H. symbiolongicarpus derivadas de un retrocruce que diferían en sus fenotipos de alorreconocimiento. Para esto, proteínas totales se extrajeron de dos grupos de colonias hermanas constituidos por individuos que se fusionaban entre sí pero que rechazaban a las colonias del otro grupo. Los proteomas de ambos grupos se compararon por electroforesis bidimensional diferencial en gel (2D-DIGE) y las proteínas expresadas diferencialmente entre los grupos se identificaron por espectrometría de masas en tandem (MS/MS). Mediante esta aproximación se identificó un total de 42 proteínas diferencialmente expresadas entre los grupos que fueron clasificadas en 7 clases funcionales: a) Enzimas (diferentes a enzimas del metabolismo y peptidasas), b) proteínas del metabolismo, c) proteínas del sistema de óxido-reducción, d) peptidasas y proteasas, e) proteínas estructurales, f) proteínas de reconocimiento y g) otras proteínas. Las proteínas de la clase de reconocimiento se consideraron potenciales alodeterminantes e incluyó 8 proteínas con dominios de interacción molecular como HSP70, Peptidoglicano, Fibrinógeno, Ribonucleasa T2, CAP, Trombospondina tipo 1 y ML. La asignación definitiva de estas proteínas candidatas como alodeterminantes requiere determinar si su variación predice los fenotipos de alorreconocimiento en H. symbiolongicarpus.

Abstract. Sessile and colonial invertebrates possess the ability to distinguish between their own tissues and those from unrelated conspecifics. This allorecognition phenomenon has been well studied in Hydractinia symbiolongicarpus, a hydrozoan that grows on the shells occupied by the hermit crab. Encounters between colonies of H. symbiolongicarpus occur frequently and result in fusion, rejection, or transitory fusion. Analyses with endogamic lines of this hydrozoan have demonstrated that allorecognition is controlled by two linked, co-dominantly expressed, and polymorphic loci (alr1 and alr2), such that colonies sharing at least one allele of any of these two loci will fuse, whereas colonies sharing no alleles will reject. Alr1 and alr2 have been characterized by positional cloning, and they encode transmembrane proteins with 2 or 3 immunoglobulin domains. Although variation of alr1 and alr2 predicts the allorecognition phenotypes in the inbreed lines, in wild-type colonies these predictions are not completely met. This suggests that there are addition allorecognition loci that might have been homogenized during the inbreeding process but that could play a role in the phenomenon in wild-type animals. With the aim of identifying these potential allodeterminants, in this work it was used a comparative proteomics approach on offspring from a H. symbiolongicarpus backcross that differed in their allorecognition phenotypes. To accomplish this aim, total protein was extracted from two groups of offspring colonies constituted by individuals that fused among themselves but rejected the colonies from the other group. The proteomes of both groups were compared by two-dimensional differential gel electrophoresis, and the proteins differentially expressed were identified by tandem mass spectrometry (MS/MS). Under this approach, there were a total of 42 proteins identified as differentially expressed between the two groups, and they were classified into seven functional classes: a) non-metabolic enzymes, b) metabolism proteins, c) redox proteins, d) proteases and peptidases, e) structural proteins, f) recognition proteins, and g) other proteins. Proteins from the recognition class were considered potential allodeterminants and it included 8 molecules with recognition domains such as HSP70, peptidoglycan recognition, fibrinogen, ribonuclease T2, CAP, thrombospondin-1 and ML. A definitive assignation of these candidate proteins as allodeterminants requires establishing that its variation predicts the allorecognition phenotypes in H. symbiolongicarpus.