Evaluación de los niveles de actividad y transcripcionales in vivo de algunas enzimas hidrolíticas secretadas por Fusarium oxysporum f.sp.dianthi en su interacción con el clavel dianthus caryophyllus L

Abstract

En el presente trabajo se evidenció la secreción de las enzimas: poligalacturonasa (PG), pectato liasa (PL), proteasa (PRT) y xilanasa (XL) por el patógeno Fusarium oxysporumf. sp.dianthi en raíces de clavel durante los primeros días de infección y luego del proceso de colonización.Para el desarrollo del trabajo inicialmente se seleccionó una metodología que permitiera extraer las 4 enzimas en un único procedimiento a partir del fluido intercelular, el extracto intracelular y el extracto crudo de la planta. Se seleccionó entre diferentes métodos que utilizaban acetona, polivinilpolipirrolidona y buffer fosfatos, el último que presentó los mejores resultados. Con los resultados, se escogió el fluido intercelular y el extracto intracelular para determinar la actividad de las enzimas en plantas sanas e infectadas. Mediante el uso de zimogramas se identificaron diferencias en los patrones electroforéticos entre la planta y el hongo para cada una de las enzimas de estudio. Para comprobar la secreción de las enzimas PG, PL, PRT y XL por parte de F oxysporum en la planta, se realizó un ensayo in vivo usando esquejes enraizados de clavel, las variedades usadas fueron Moonlight y Golem con niveles de resistencia medio y alto, se emplearon cuatro tratamientos que comprendían dos controles sin inocular y dos inoculados con el patógeno. Los análisis de actividad enzimática, en los extractos obtenidos se realizaron en dos bloques: durante los primeros días pos inoculación (0-10) y en los días (37- 43), usando cuatro réplicas biológicas para cada variedad infectada y sus respectivos controles. En los primeros días pos inoculación los mayores niveles de actividad se presentaron en el fluido intercelular y en general en las muestras infectadas de la variedad Golem. Mostrando como el grado de resistencia de la variedad puede influir, así mismo al observar los mayores niveles en el espacio intercelular, se comprueba la secreción de estas en el apoplasto. Se observó una secreción diferencial de las enzimas en la planta por parte del hongo en los primeros días de infección, donde las enzimas pécticas que primero se expresan son las poligalacturonasas, seguido de las pectato liasas, luego las proteasas indicando que muy probablemente las enzimas pécticas son decisivas en el proceso de infección, para el caso de la xilanasa no se evidenció actividad en el fluido intercelular para estos tiempos. En el segundo bloque la actividad de las muestras infectadas tiende a igualarse con las muestras control para la variedad que Moonlight, mientras que en la variedad Golem la actividad de las muestras infectadas es mayor al control, comportamiento relacionado con los niveles de resistencia. Para la determinación de los niveles transcripcionales en el extracto crudo obtenido de raíces de las enzimas proteasa y pectato liasa mediante qPCR se diseñaron primers para un fragmento de los genes que codifican las enzimas proteasas (prt) y pectato liasas (pl) y para la subunidad 18 s rRNA cuya especificidad fue ensayada en hongo y planta. La extracción del RNA de las muestras fue realizada mediante el método del trizol, seguido de un tratamiento con DNasa y la síntesis del cDNA. Los primers diseñados permitieron, luego de algunos ajustes al procedimiento, la determinación de los niveles transcripcionales de las enzimas pectato liasa y proteasa en el ensayo in vivo. Se confirmó, con la determinación de los niveles transcripcionales la secreción de proteasa y pectato liasa a la planta por parte de Fod, con patrones de secreción semejantes a los obtenidos en la determinación de actividad de estas enzimas. Los primers diseñados para una parte del genoma que codifica para el gen 18s rRNA permitieron realizar el seguimiento de la cantidad de hongo en la planta. La variedad que presentó los mayores niveles de transcripción para las enzimas proteasa y pectato liasa fue la Moonligth, indicando relación entre la resistencia de la variedad y niveles de expresión.

Abstract. In this work the secretion of enzymes was evidenced: polygalacturonase (PG), pectate lyase (PL), protease (PRT) y xylanase (XL) was detected for the pathogen Fusarium oxysporumf. sp.dianthi during the first days of infection and colonization process in carnation’s roots. Initially a specific methodology was selected in order to extract the 4 enzymes during a unique procedure from intercellular fluid, intracellular extract and crude extract of the plant. This method was selected from those using acetone, polyvinylpolypyrrolidone and phosphate buffer, the latter showing the best results. The intercellular fluid and intracellular extract were chosen to determine enzyme activity of healthy and infected plants. By the use of Zymograms, important differences were detected between electrophoretic patterns of the plant and the fungus for each one of the studied enzymes. To probe the secretion of PG, PL, PRT and XL by F oxysporum in the plant, in vivo studies were made using carnation rooted cuttings with varieties Moonlight and Golem which exhibit medium and high levels of resistance, four treatments that included two controls without inoculation and two inoculated with the pathogen were employed. Enzymatic activity analyses with the obtained extracts were made in two blocks: during the first days posinoculation (0-10) and days (37-43), using 4 biological replicates for each infected variety and their respective controls. During the first days pos inoculation, the highest levels of activity were detected in intercellular fluid, in general for infected samples of Golem variety. Showing the influence of the plant variety, the secretion was also probed in apoplast. A differential enzymes secretion was observed by the fungus in the plant during the first days of infection, where the pectic enzymes that are first expressed are polygalacturonase, followed by pectate lyase, and then proteases suggesting that pectic enzymes are crucial for the infection process, in the case of xylanase no activity was detected in the intercellular fluid for these times. In the second block, the activity of infected samples tend to equal the control samples for the Moonligth variety, for Golem variety the activity is higher for infected samples compared with control, this behavior is related to resistance levels. For the determination of transcriptional levels of the enzymes protease and pectate lyase in the crude extract obtained from roots of enzymes by qPCR, primers were designed for a fragment of the genes that codify the enzymes proteases (prt), pectate lyase (pl) and the 18s rRNA subunit whose activity was tested in fungus and plant. RNA extraction was carried out through trizol method, followed by DNase treatment and cDNA synthesis. Designed primers allowed after optimization, the determination of transcriptional levels of the enzimes pectate lyase and protease during in vivo assay. Protease and pectate lyase secretion was confirmed by Fod, with similar secretion patterns to the observed ones in the activity determination of these enzymes. Designed primers for the gene that codifies 18s rRNA subunit allowed to follow the amount of fungus in the plant. The varieties that showed the highest transcript levels for enzymes protease and pectate lyase was Moonligth indicating relationship between the resistance of the variety and expression levels.